聚二甲基硅氧烷(PDMS)/玻璃微流控芯片電泳快速分離血清高密度脂蛋白亞類及臨床應(yīng)用研究

摘 要 經(jīng)梯度密度超速離心，高密度脂蛋白（HDL）分為HDL2和HDL3兩亞型。HDL2抑制低密度脂蛋白（LDL）氧化功能受損是冠心?。–HD）發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此， 通過對(duì)HDL亞類進(jìn)行分離，從而達(dá)到預(yù)測(cè)和診斷CHD的目的。本研究建立了用PDMS/玻璃微流控芯片快速電泳分離HDL亞類的方法。選擇N十二烷基βD麥芽糖苷（DDM）、十二烷基硫酸鈉（SDS）和羥丙基纖維素（HPC）共同修飾脂蛋白和泳道表面。在以含0.3 mmol/L SDS的50 mmol/L 3（N嗎啉代）丙磺酸（MOPS）（pH 8.0）為樣品緩沖液， 含0.6% HPC的50 mmol/L MOPS （pH 8.0）為分離緩沖液， 分離電壓為260 V/cm的優(yōu)化條件下， HDL2和HDL3在4 min內(nèi)得到基線分離，二者的出峰時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）分別是2.0%和2.7%， 2.0%和2.9%，具有較好的重復(fù)性。臨床標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)， 正常人血清標(biāo)本可分離出HDL2和HDL3雙峰，而CHD患者的HDL2峰面積顯著減小，甚至消失。PDMS/玻璃微流控芯片分離HDL亞類是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的用于分析CHD危險(xiǎn)因子的方法。

關(guān)鍵詞 PDMS/玻璃微流控芯片電泳； 冠心病； 高密度脂蛋白亞分

1 引 言

流行病學(xué)研究表明，氧化低密度脂蛋白（LDL）在冠心?。–HD）的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而高密度脂蛋白（HDL）水平與CHD發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。過去的研究認(rèn)為，HDL對(duì)心血管的保護(hù)作用是通過逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇實(shí)現(xiàn)的; 而最新的研究發(fā)現(xiàn)， 該作用更多的是依賴其抑制LDL氧化實(shí)現(xiàn)的。HDL抗LDL氧化修飾是通過減少LDL導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化和抑制單核細(xì)胞在動(dòng)脈管壁的聚集兩條途徑共同實(shí)現(xiàn)的。采用梯度密度超速離心法可將人類HDL分為HDL2和HDL3兩種亞型。雖然HDL3比HDL2抗LDL氧化功能更強(qiáng)，但CHD患者的HDL2而非HDL3抗氧化功能受損，具體機(jī)制不明。

近年來，多聚物在微流控領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛，其中PDMS是迄今為止最常用于微流控芯片制備的多聚物。PDMS是一種常見的高分子聚合有機(jī)材料，具有價(jià)格低廉，易于構(gòu)筑，透光、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易于與玻璃等其它材料鍵合，無毒及生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)。但也存在多孔疏水、表面電荷低、電滲流（EOF）小等缺點(diǎn)。因此，在未經(jīng)修飾的PDMS微流控芯片上進(jìn)行蛋白分離時(shí)，常出現(xiàn)峰拖尾和不能有效分離的現(xiàn)象。對(duì)PDMS進(jìn)行表面修飾是一種拓寬其應(yīng)用范圍的有效方法，目前的修飾方法種類眾多，其中動(dòng)態(tài)修飾是一種最簡(jiǎn)單有效的方法，通常是在緩沖液中加入類似多聚物或表面活性劑等物質(zhì)。 

目前HDL亞類的分析方法主要有超速離心法、梯度凝膠電泳法、質(zhì)子核磁共振光譜法、免疫親和層析法、雙向電泳免疫印跡法等，這些方法多存在費(fèi)時(shí)耗力，技術(shù)要求高及儀器復(fù)雜等不足，更多的是進(jìn)行基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)，難于在臨床應(yīng)用。二氧化硅微流控芯片電泳法是目前HDL亞類分離最簡(jiǎn)便有效的方法 ，但二氧化硅構(gòu)筑微流控芯片價(jià)格昂貴、耗時(shí)，且需要特殊設(shè)備，還受特殊加工工藝的限制。而PDMS/玻璃微流控芯片分離法是一種適合于臨床實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模應(yīng)用的HDL亞類分離法。本研究采用PDMS/玻璃微流控芯片進(jìn)行HDL亞類分離的研究。選擇DDM，SDS和HPC共同修飾脂蛋白和泳道表面后，明顯減弱了PDMS對(duì)HDL的吸附，并在優(yōu)化各種分離條件下，成功使血清標(biāo)本HDL2和HDL3亞分得到基線分離，且具有很好的重復(fù)性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與標(biāo)本

激光誘導(dǎo)熒光（Laser induced fluorescence， LIF）檢測(cè)系統(tǒng) （自行研制）；OptimaTM L90K 型超速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）；CX 系統(tǒng)電源 （0～5000 V）、甩膠機(jī)、紫外曝光機(jī)（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所）。

HDL標(biāo)準(zhǔn)品（15.6 g/L）， MOPS， DDM， SDS， HPC， 乙二醇、甲醇、異丙醇、丙酮、磷鎢酸 （PTA）、MgCl2， KBr， SU8負(fù)性光刻膠（美國(guó)Sigma 公司）；丙二醇單甲醚乙酸酯（江蘇省江陰市江化微電子材料有限公司）；硝基苯并 二唑C6酰基鞘胺醇（NBD C6ceramide，美國(guó) Molecular Probes公司）。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，試劑配制好后均用0.22

SymbolmA@ m濾膜過濾。 

1. 樣品池（Sample reservoir）; 2. 樣品廢液池（Sample waste reservoir）; 3. 緩沖液池（Buffer reservoir）; 4. 緩沖液廢液池（Buffer waster reservoir）。

標(biāo)本取自本院經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)的 CHD 患者及健康體檢者。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 芯片制備（圖1 A） （1）硅片模板制作 硅片經(jīng)清洗后涂SU8膠；以3000 r/s離心甩膠60 s；前期烘干的溫度梯度為50 ℃→60 ℃→65 ℃→75 ℃→85 ℃→90 ℃→95 ℃；在波長(zhǎng)400 nm、光強(qiáng)200 mJ/cm2下曝光75 s；后期烘干的溫度梯度為50 ℃→60 ℃→75 ℃→85 ℃→95 ℃；硅片于顯影液中（丙二醇單甲醚乙酸酯）超聲約10 min，顯影后洗凈吹干后備用（涂SU8膠以后的操作須避光）。（2）PDMS/玻璃微流控芯片制作 PDMS與固化劑以質(zhì)量比10∶1的比例攪拌均勻，經(jīng)真空處理后，將混合物倒入硅片模板上，置于90 ℃熱板上固化；將包含泳道部分的PDMS切下，并在相應(yīng)位置打孔；將PDMS與載玻片共同置于等離子體清洗器中處理后鍵合。芯片大小為64 mm×32 mm，管道寬100

SymbolmA@ m，深約25

SymbolmA@ m，樣品池到十字交叉點(diǎn)長(zhǎng)4 mm，有效分離長(zhǎng)度為42 mm，儲(chǔ)液池的直徑為2 mm。樣品池1和樣品廢液池2間通道用于進(jìn)樣，緩沖液池3和緩沖液廢液池4間通道用于電泳分離，如圖1B所示。

2.2.2 芯片電泳過程 在芯片樣品廢液池、緩沖液池和緩沖液廢液池中分別加入分離緩沖液，并使通道內(nèi)充滿分離緩沖液；在樣品池中加入樣品，使激光束聚焦于芯片分離通道下檢測(cè)點(diǎn)處。按下列程序分別向4個(gè)儲(chǔ)液池施加電壓，進(jìn)行進(jìn)樣和分離操作：進(jìn)樣40 s，樣品池、樣品廢液池、緩沖液池和緩沖液廢液池分別施加450， 0， 150和280 V電壓；分離4 min，各池分別施加300， 300， 2000和0 V電壓，運(yùn)行溫度25 ℃。 

2.2.3 電泳原理 PDMS/玻璃芯片泳道表面經(jīng)DDM修飾后，管壁凈電荷為零，泳道內(nèi)EOF也幾乎消失。HDL是一種酸性脂蛋白，在pH 8.0的緩沖液中帶負(fù)電荷。因此，HDL在PDMS分離泳道中只受外加電場(chǎng)力作用，由負(fù)極向正極遷移，通過末端檢測(cè)器檢測(cè)得到電泳圖譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 DDM， HPC共同修飾后HDL亞類的分離效果

根據(jù)本課題組先前的研究結(jié)果，選用DDM和HPC共同修飾泳道表面。DDM屬于溫和型非離子型表面活性劑，能強(qiáng)烈吸附于疏水表面并形成親水性非離子性單層，從而減少蛋白對(duì)于疏水表面的吸附。HPC是一種纖維素衍生物，在蛋白質(zhì)分離時(shí)可作為篩分介質(zhì)來填充泳道。HPC在較高濃度時(shí)也不會(huì)導(dǎo)致粘滯性增加，因此可方便地進(jìn)行泳道灌注。用0.01% DDM修飾泳道30 min后，以含0.6% HPC的50 mmol/L MOPS（pH 7.2）作為分離緩沖液，50 mmol/L MOPS（pH 7.2）作為樣品緩沖液。HDL標(biāo)準(zhǔn)品、超速離心所得HDL亞型及其混合物的分離效果見圖2。

3.2 SDS濃度對(duì)HDL分離效果的影響?yīng)?/p>

在給定pH條件下，蛋白質(zhì)各組分相互分離的根本原因是其質(zhì)荷比差異，因此要提高HDL亞類的分離度，必須增加其亞類間的質(zhì)荷比。SDS是一種陰離子表面活性劑，能將脂蛋白外殼的載脂蛋白氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到載脂蛋白上，形成SDS脂蛋白復(fù)合物，不同的脂蛋白顆粒結(jié)合不同數(shù)量的SDS，導(dǎo)致顆粒間的質(zhì)荷比發(fā)生變化，從而提高分離效率。HDL2蛋白含量高于HDL3，因此HDL2可結(jié)合更多數(shù)量的SDS，所帶負(fù)電荷更多，遷移速度也更快。依據(jù)此理論，研究了含不同SDS濃度的樣品緩沖液對(duì)HDL亞分分離度的影響。結(jié)果表明， 在pH 7.2、50 mmol/L MOPS樣本緩沖液中加入0.3 mmol/L SDS，可使HDL2和HDL3亞分得到基線分離，SDS濃度過小或過大，分離效果都欠佳，如圖3所示。

3.3 pH值對(duì)HDL2和HDL3分離度的影響及HDL亞類峰型的鑒定

通過調(diào)節(jié)pH值的進(jìn)一步優(yōu)化HDL2和HDL3的分離條件。當(dāng)緩沖液pH＝8.0時(shí)，HDL2和HDL3的分離度最大，結(jié)果如圖 4A所示。在此優(yōu)化條件下，將超速離心所得HDL2與HDL3混合物和HDL標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行了電泳分離，結(jié)果如圖 4B和圖4C所示。為了研究圖 4B和圖4C兩峰分別屬于何種亞型，在HDL標(biāo)準(zhǔn)品中分別加入了HDL2和HDL3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入HDL2亞型的標(biāo)準(zhǔn)品，前遷移峰面積顯著增加；加入HDL3亞型的標(biāo)準(zhǔn)品，后遷移峰面積顯著增加（圖4D和圖4E）。說明PDMS/玻璃微流控芯片電泳分離HDL亞型時(shí)，HDL2 的遷移速度比HDL3快。

圖3 SDS濃度對(duì)HDL標(biāo)準(zhǔn)品分離的影響?yīng)?/p>

Fig．3 Effect of SDS concentration on standard HDL separation

樣品緩沖液中SDS濃度（Concentration of SDS in sample buffer）: A. 0.1 mmol/L; B. 0.2 mmol/L; C. 0.3 mmol/L; D. 0.4 mmol/L。

3.4 重復(fù)性研究

將HDL標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)5次進(jìn)樣分離，HDL2和HDL3的出峰時(shí)間和出峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.1%和 2.7%，2.0%和2.9%，顯示重復(fù)性良好。

3.5 臨床血清標(biāo)本HDL亞類分析

采用PTAMg2+沉淀劑 （1.52 mmol/L PTA， 0.05 mol/L MgCl2，pH＝6.1）將血清標(biāo)本中除HDL外的脂蛋白通過超速離心沉淀除去，則上清液中所含脂蛋白即HDL。處理后血清中的熒光信號(hào)是NBDC6標(biāo)記的HDL所產(chǎn)生。由健康體檢者和CHD患者血清標(biāo)本電泳分離HDL亞類結(jié)果（圖5）可見，健康體檢者有HDL2和 HDL3雙峰，而CHD患者HDL2峰面積顯著減小，甚至消失。這可能是由于CHD患者體內(nèi)HDL2抗LDL氧化功能受損所致。

3.6 CHD患者與健康體檢者HDL亞類峰面積的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用x±s表達(dá)。組間差異比較使用方差分析，p＜0.05有顯著性差異。表 1為受試血清標(biāo)本HDL2和HDL3峰面積的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。CHD患者HDL2峰面積顯著低于健康體檢者組（p＜0.01），而HDL3峰面積與健康體檢者組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HDL2含量減少是CHD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

本研究結(jié)果表明，以PDMS/玻璃微流控芯片電泳技術(shù)為平臺(tái)，結(jié)合LIF檢測(cè)系統(tǒng)，血清HDL亞類分離的穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好，芯片構(gòu)筑簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉，且可一次性使用，彌補(bǔ)了二氧化硅芯的不足，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。 

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Application of Polydimethylsiloxane/Glass Microchip for Fast Electrophoretic

Separation of Serum Highdensity Lipoprotein Subclasses

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QIAN JingJing1， JI HuoYan1，2， CONG Hui1， WANG HuiMin*1， JIN QingHui2

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1（Affiliated Hospital of Nantong University， Nantong 226001）

2（Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology， Shanghai 200005）

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Abstract On the basis of density by ultracentrifugation， high density lipoprotein （HDL） can be separated into two major subfractions: HDL2 and HDL3. The capacity of HDL2， but not of HDL2， to inhibit the oxidative modification of low density lipoprotein （LDL） is impaired， which is believed to play a central role in coronary heart disease （CHD）， so HDL subclasses separation is necessary for CHD prediction and diagnosis. In this paper， polydimethylsiloxane（PDMS）/glass microchip was used. We chose DDM， SDS and HPC to modify both lipoprotein and the channel surface to reduce lipoprotein adsorption and improve the resolution of lipoprotein separation. Under the optimal conditions， HDL2 and HDL3 were effectively baseline separated with high reproducibility. RSD values of the migration time and peak areas of HDL2 and HDL3 were 2.1% and 2.7%， and 2.0% and 2.9%， respectively. Serum HDL subclasses of healthy ones and patients with CHD were separated by PDMSbased microchip. Two peaks （HDL2 and HDL3） were detected in serum samples of healthy ones while HDL2 fractional peaks almost disappeared in patients′ entire serum samples. These results suggested that PDMS/glass microchipbased HDL subclasses assay was a simple， rapid， and highly efficient technique for CHD risk factors analysis. 

Keywords Polydimethylsiloxane/glass microchip electrophoresis; Coronary heart disease; Subclasses of high density lipoprotein

（Received 15 March 2011; accepted 17 May 2011）