基于強陽離子交換色譜與等電聚焦的磷酸化蛋白質組學分離策略比較

摘 要 比較分析了強陽離子交換（SCX）與等電聚焦（IPG-IEF）技術在磷酸化蛋白質組學中的應用。采用3種標準磷酸化蛋白對SCX與IPG-IEF兩種技術對磷酸化肽段富集的有效性進行考察。以HepG2細胞為復雜樣本，考察SCX與IPG-IEF在實際樣本中的應用情況。對SCX與IPG-IEF技術在18O標記的磷酸化蛋白質組定量研究中的應用情況進行考察。蛋白鑒定采用高準確度、高靈敏度、高分辨率的LTQ-FTICR-MS/MS質譜儀。實驗表明： SCX和IPG-IEF 在大規模磷酸化肽段分離過程中均有效；在復雜樣本中，SCX技術的分離效果優于IPG-IEF； IPG-IEF的重復性好于SCX；在磷酸化蛋白質組定量分析結果表明，IPG-IEF技術的穩定性優于SCX。本研究為根據不同實驗目的而選擇適當的磷酸化蛋白質組預分離技術提供了有用信息。

關鍵詞 磷酸化肽段分離；強陽離子交換；等電聚焦；傅里葉交換離子回旋質譜

1 引 言

磷酸化修飾是調節細胞內蛋白活性和信號傳導的重要翻譯后修飾之一。因此獲得磷酸化蛋白和磷酸化位點的信息對深入理解細胞的調節過程和信號傳導是十分重要的。雖然細胞內能發生磷酸化的蛋白較多，但磷酸化蛋白的量卻很少，而且蛋白磷酸化的動態性以及特定的磷酸化位點的化學計量值較低等因素使得磷酸化蛋白的鑒定，特別是大規模的磷酸化蛋白質組學分析十分困難。鑒于此，對磷酸化肽段進行預分離，降低樣本的復雜性，從而提高磷酸化肽段的相對濃度，是十分必要的。

目前，已建立了一些磷酸化肽段富集策略，如固相金屬親和色譜（Immobilized metal affinity chromatography， IMAC），強陽離子交換色譜（Strong cation exchange， SCX），二氧化鈦（TiO2），等電聚焦（Isoelectric focusing on an immobilized pH gradient gel， IPG-IEF）等技術。其中IMAC和TiO2技術常用于大規模磷酸化肽段聯合富集路線中的二維富集。自Beausoll等將SCX成功應用到磷酸化肽段的富集后，SCX已成為大規模磷酸化蛋白質組聯合富集路線中最常用的一維分離技術。近期，以IEF為分離原理的技術被引進，用于分離胰蛋白酶酶解肽段混合物，該技術可能成為大規模磷酸化蛋白質組學分析中聯合富集路線中的一維分離技術。為了考察IEF和SCX的有效性，本研究對SCX和IPG-IEF在磷酸化蛋白質組學中的應用，包括定性和定量兩方面，進行了比較研究，為根據實驗目的而選擇適當的磷酸化蛋白質組學預分離技術，提供了有用信息。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

毛細管高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質譜儀（CapLC-ESI-LTQ-FTICR， Thermo Finnigan），毛細管色譜由安捷倫1100系統控制，由自動上樣系統、上樣泵（含一個十通閥）和二元洗脫泵組成（Agillent 1100， Agillent公司）; ProteomeLab PF 2D型兩維高效液相色譜系統，包括雙泵反相色譜儀、自動餾分收集及進樣器和32 Karat色譜工作站（美國Beckman公司），并在反相色譜之后連接自動餾分收集器（Gilson公司）; IPGphor水平電泳儀（Amersham Pharmacia公司）。

乙腈（HPLC 級， 美國J. T. Baker 公司）；三氟乙酸（TFA）和碘乙酰胺（Iodoacetamide，比利時ACROS 公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Sequencing grade）和二硫蘇糖醇（Dithiothreithol， DTT）購于美國Promega 公司；HepG2細胞（北京市人民醫院饋贈）；牛α-酪蛋白（α-Casein）、β-酪蛋白（β-Casein）、雞卵白蛋白（Ovalbumin）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）、Na2VO3、甲酸（FA）和NaF（美國Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（德國Roche公司）。H218O （97%，上海化工研究所）。超純水由 Millipore 純水系統制備；其它試劑均為色譜純。

2.2 實驗方法

2.2.1 蛋白酶切 取3種標準磷酸化蛋白：牛α-酪蛋白、β-酪蛋白和雞卵白蛋白各200

SymbolmA@ g溶于100

SymbolmA@ L含有尿素（8 mol/L）、DTT（10 mmol/L）、NH4HCO3（50 mmol/L）的溶液中，置37 ℃水浴中還原4 h， 然后加入5

SymbolmA@ L碘乙酰胺（1 mol/L），放置暗處1 h，進行烷基化，加700

SymbolmA@ L NH4HCO3（50 mmol/L）溶液，將尿素稀釋到1 mol/L以下，最后加入12

SymbolmA@ g胰蛋白酶，在37 ℃保溫反應16 h。

2.2.2 SCX色譜分離磷酸化肽段 實驗在ProteomeLab PF 2D型兩維高效液相色譜系統（美國Beckman公司）上進行，流動相A（5 mmol/L NH4H2PO4-40% ACN， pH 2.7）和流動相B（5 mmol/L NH4H2PO4-40% ACN-350 mmol/L NH4Cl）用于形成鹽梯度。梯度設置為0% B保持 7 min；1 min內至15% B； 5 min內至25% B， 并保持10 min；10 min內至60% B；1 min 內至100% B， 并保持10 min；1 min內至100% A。流速為0.7 mL/min， 檢測波長為 214 nm， 用自動化的Gillson 215 liquid handler （Gillson， Middleton， WI， USA）每分鐘收集一個餾分，共收集40個。SCX色譜柱為Hypersil SCX強陽離子交換柱（150 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m，300 ， Thermo Keystone）。

2.2.3 IPG-IEF分離富集磷酸化肽段 膠內溶脹上樣：將蛋白酶切肽段混合物溶于348.25

SymbolmA@ L 8 mol/L尿素中，然后加入1.75

SymbolmA@ L 0.5% IPG 緩沖液，共350

SymbolmA@ L，膠內溶脹上樣。溶脹和IEF的操作參數見表1。

放置IPG干膠條：選用18 cm、pH 3～10的線性IPG干膠條，從IPG干膠條酸性端除去保護膜，并且使膠條酸性端靠著持膠槽突起的一端，使膠條膠面朝下貼近溶液。為了使膠條被溶液浸潤，慢慢抬高或放低膠條，并且沿著液體表面來回滑動。注意不要使IPG膠條底部產生氣泡。在IPG膠條上鋪一層1 mL IPG覆蓋液（IPG cover Fluid），以減少蒸發和尿素結晶。按表1設置相應的等電聚焦程序。等電聚焦完成后，用電極液和超純水沖洗IPG膠條，然后剪成33份，并用200

SymbolmA@ L 50% ACN-0.1% TFA 溶液提取。

 

2.2.4 18O穩定同位素標記磷酸化肽段 酶切后18O標記方法：取兩等份酶切肽段混合物分別放于兩支管中，進行平行標記實驗。真空冷凍干燥后，分別加入2.75

SymbolmA@ L 50 mmol/L KH2PO4 （pH 4～5），并真空冷凍干燥；各加10

SymbolmA@ L H216O和H218O （97%），放于37 ℃水浴鍋中19～24 h；將上述兩等份標記完全的肽段混合物放于微波爐中加熱10 min， 使胰蛋白酶變性；分別轉移到兩管充分干燥后的等量胰蛋白酶變性液（1 mmol/L pH 7.0， tris（2-carboxyethyl）-phosphine， TCEP）中，放置于37 ℃水浴鍋中1 h，使胰蛋白酶充分變性；分別轉移到兩管充分干燥后的等量烷基化試劑（1 mmol/L碘乙酰胺，3 mol/L鹽酸胍）中，在37 ℃水浴中繼續孵育90 min。

2.2.5 液相色譜-質譜聯用分析 （1）液相色譜條件 分析柱為PicoFritTM反相柱（BioBasic C18， 5

SymbolmA@ m， 10 cm×75

SymbolmA@ m i.d， 15

SymbolmA@ m i.d. spray tip， New Objective， Woburn， MA， USA）。流動相A：98%水溶液/0.1%FA；流動相B：80% ACN-0.1% FA。洗脫條件：0～80 min， 0%～40% B；80～95 min，40%～100% B； 95～115 min， 100% B；115～120 min，100%～0% B，以100% A平衡色譜柱10 min，流速為0.7 mL/min; （2） 質譜條件 從反相柱流出的洗脫組分由納升級電噴霧接口噴出。電噴霧電壓1.8 kV; 離子傳輸毛細管溫度為200 ℃；質譜采用全掃描（Mass range， m/z 400～2000）一級質譜的數據依賴的二級質譜掃描模式（Data dependent MS/MS scan），依次選取一級質譜中離子強度最強的3個離子進行CID串聯質譜，動態排除歸一化碰撞能量為35%；采用串聯質譜掃描的動態排除功能， 設置排除時間為15 s。

2.2.6 質譜數據的檢索 所有串聯質譜數據均用Thermo Finnigan Bioworks 3.2SR1整合的Sequest檢索軟件對IPI（Ver.3.22）人蛋白質數據庫檢索。所用蛋白酶選擇Trypsin，允許所酶切的肽段有2個漏切位點，固定修飾為Carbamidomethyl （C），可變修飾為Oxidation （M），Phospho （ST）和Phospho （Y），一級質譜質量誤差設為10×10－6。為了考察所得結果的可信度，建立了反轉數據庫，將每個蛋白質的氨基酸順序倒轉。所有的二級圖譜對構建的IPI（Ver.3.22）正反混合數據庫進行檢索。18O標記的肽段的檢索鑒定還需加上修飾（C-terminal） （＋4 Da）。

用BuildSummary軟件對得到的Sequest檢索結果進行整合。數據過濾參數設置為：16O標記的肽段：Xcorr≥1.9，1＋；Xcorr≥2.6，2＋； Xcorr≥3.0，3＋；Rsp≤4。18O標記的肽段：Xcorr≥1.9，1＋；Xcorr≥2.7，2＋； Xcorr≥3.3，3＋；Rsp≤4。假陽性率都控制在1%以內。

3 結果與討論

3.1 SCX-LTQ-FT和IPG-IEF-LTQ-FT兩條磷酸化肽段富集路線的建立及有效性比較



SCX分離磷酸化肽段策略是基于磷酸化肽段與非磷酸化肽段在酸性溶液中所帶電荷的不同達到分離的目的。在溶液pH＝2.7時，胰蛋白酶的酶切產物大部分肽段帶＋2電荷，而磷酸化肽段由于含有磷酸基團，帶一個負電荷，磷酸化肽段在酸性溶液中帶＋1電荷。在強陽離子交換色譜中，單電荷肽段比多電荷肽段流出時間早，因此磷酸化肽段便能從多電荷復雜的非磷酸肽段中分離富集。

基于肽段等電點的不同而發展的等電焦技術已成熟地應用于二維凝膠電泳中分離復雜蛋白混合物。近年，該技術又被用于分離胰蛋白酶酶解肽段混合物。該策略的機理是由于磷酸化肽段磷酸基團的負電性，其等電點會比非磷酸化肽段低，從而分布在低pH值的酸性端。該策略包括自由流電泳（FFE）、毛細管電泳和基于IPG膠條的等電聚焦（IPG-IEF）等。其中，IPG-IEF操作方便，且所需樣本量少，較受關注。本研究采用IPG-IEF技術分離磷酸化肽段。

為了考察SCX和IPG-IEF的有效性，建立了SCX-LTQ-FT 和 IPG-IEF-LTQ-FT兩條技術路線。采用3種標準磷酸化蛋白對SCX與IPG-IEF兩種技術對磷酸化肽段富集的有效性進行考察。以HepG2細胞為復雜樣本，考察SCX與IPG-IEF在實際樣本中的應用情況。對SCX與IPG-IEF技術在18O標記的磷酸化蛋白質組定量研究中的應用情況進行考察。蛋白鑒定采用高準確度、高靈敏度、高分辨率的LTQ-FTICR-MS/MS質譜儀。本研究技術路線見圖1。

采用SCX和IPG-IEF分別富集3種標準磷酸化蛋白的酶切肽段混合物中的磷酸化肽段。從表2可見，SCX技術富集鑒定到13個磷酸化肽段，其中8個磷酸化肽段在未SCX富集時是觀察不到的，SCX使富集有效性提高了61.5%。從表3可見，IPG-IEF技術富集鑒定到11個磷酸化肽段，其中6個磷酸化肽段在沒有IPG-IEF富集時是看不到的，IPG-IEF使富集有效性提高了54.5%。上述實驗重復3次，結果基本一致，表明SCX和IPG-IEF對磷酸化肽段富集都是有效的，而且二者在分離富集標準磷酸化蛋白的磷酸化肽段的能力是基本等效的。

考慮到對SCX和IPG-IEF的比較結果，僅用簡單的標準磷酸化蛋白樣本有時并不能完全說明問題，因此進一步將SCX-LTQ-FT和IPG-IEF-LTQ-FT兩條技術路線分別應用到復雜樣本HepG2細胞中，對其磷酸化肽段的富集能力進行比較，重復實驗3次，得到基本一致的實驗結果（表4）。SCX-LTQ-FT 路線從HepG2細胞中鑒定到347個磷酸化蛋白、350個磷酸化肽段和527個磷酸化位點，IPG-IEF-LTQ-FT路線從HepG2細胞中鑒定到226個磷酸化蛋白、228個磷酸化肽段和325個磷酸化位點。以上結果表明，在復雜樣本中，SCX對磷酸化肽段的富集能力明顯優于IPG-IEF。原因可能是，肽段序列中含有Asp/Glu酸性氨基酸的非磷酸化肽段對IPG-IEF的富集有一定的干擾。但不管怎樣，IPG-IEF仍然能夠有效地降低肽段混合物的復雜性，最終得到磷酸化肽段含量較高的肽段混合物，起到有效富集作用。此外，IPG-IEF對磷酸化肽段富集的的重復性（約50%）優于SCX（約30%）。

3.2 SCX-LTQ-FT 和 IPG-IEF-LTQ-FT兩條磷酸化肽段富集路線在定量分析中的比較

將SCX和IPG-IEF路線應用到18O標記的磷酸化肽段中，研究二者在磷酸化蛋白質組學定量分析中的穩定性。結果表明，18O標記的磷酸化肽段在IPG-IEF路線中穩定性非常好，大部分磷酸化肽段標記誤差小于5%; 而18O∶16O＝1∶1標記的磷酸化肽段在SCX富集路線中穩定性卻較差（圖2，表5）。

18O標記磷酸化肽段在IPG-IEF與SCX分離富集路線中穩定性 （A1和A2）磷酸化肽段

VPQLEIVPNS*AEER（m/z＝830.90）；（B1和B2）磷酸化肽段K.YKVPQLEIVPNS*AEER.L（m/z 976.49）; （ C1和C2）磷酸化肽段R.EVVGS*AEAGVDAASVSEEFR.A （m/z 1044.96）

Fig．2 Investigation of the stability of 18O labeling phosphopeptides under IPG-IEF and SCX for VPQLEIVPNS*AEER （m/z＝830.91） （A1 and A2）， K.YKVPQLEIVPNS*AEER.L （m/z 976.49） （B1 and B2） and R.EVVGS*AEAGVDAASVSEEFR.A（m/z 1044.96） （C1 and C2）

這表明相同比例混合的18O與16O標記的磷酸化肽段，其標記誤差經SCX富集路線分離后比IPG-IEF路線明顯偏大，有的肽段標記誤差甚至高達79%（圖2A2，表5）。所以， 18O標記的磷酸化肽段經IPG-IEF路線富集后，定量結果比SCX更接近真實值，也就是說IPG-IEF更適合用于18O標記的磷酸化肽段的分離富集。因此，在18O標記磷酸化蛋白質組學定量分析研究中，一般選擇IPG-IEF作為預分離技術。

4 結 論

建立了SCX-LTQ-FT 和 IPG-IEF-LTQ-FT兩條技術路線，并將其應用到標準磷酸化蛋白和HepG2細胞中，對其在磷酸化蛋白質組學定性和定量分析中的應用情況進行了比較分析。實驗表明，SCX和IPG-IEF技術在磷酸化肽段分離富集中都是有效的，SCX在復雜樣本的大規模分析中優于IPG-IEF的富集效果。然而，18O 標記磷酸化肽段在SCX路線中的穩定性卻不如IPG-IEF，即磷酸化蛋白定量分析時，應優選IPG-IEF技術。因此，本研究為根據不同實驗目的選擇適當的磷酸化蛋白質組學預分離技術提供了有用信息。

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References

1 Kumar G K， Prabhakar N R. Respir. Physiol. Neurobio.， 2008， 164（1-2）: 272～276

2 Harsha H C， Pandey A. Mol. Onc.， 2010， 4（6）: 482～495

3 BAI Zhao-Fang， WANG Hong-Xia. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（9）: 1382～1389

柏兆方， 王紅霞. 分析化學， 2009， 37（9）: 1382～1389

４ Blackburn K， Goshe M B. Brief Funct. Genomic Proteomic， 2009， 8（2）: 90～103

５ WU Jian-Hong， XIAO Kuang， ZHAO Yong， ZHANG Wei-Ping， GUO Lin， FENG Yu-Qi. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（9）: 1231～１２３７

吳劍虹， 肖 礦， 趙 勇， 章偉平， 郭 林， 馮鈺锜. 分析化學， 2010， 38（9）: 1231～１２３７

6 Thingholm T E， Jensen O N， Larsen M R. Methods Mol. Biol.， 2009， 527: 67～78

7 Beausoleil S A， Jedrychowski M， Schwartz D， Elias J E， Villen J， Li J， Cohn M A， Cantley L C， Gygi S P. Proc. Natl. Acad. Sci.， 2004， 101（33）: 12130～12135

8 Parker J L， Jones A M， Serazetdinova L， Saalbach G， Bibb M J， Naldrett M J. Proteomics， 2010， 10（13）: 2486～2497

9 Thingholm T E， Larsen M R. Methods Mol. Biol.， 2009， 527: 57～66

10 Rogers L D， Fang Y， Foster L J. Mol. Biosyst.， 2010， 6（5）: 822～829

11 SUI Shao-Hui， WANG Jing-Lan， LU Zhuang， CAI Yun， ZHANG Yang-Jun， YU Wen-Feng， QIAN Xiao-Hong. Chin J. Chromatogr.， 2008， 26（2）: 195～199

隋少卉， 王京蘭， 盧 莊， 蔡 耘， 張養軍， 蔚文峰， 錢小紅. 色譜， 2008， 26（2）: 195～199

12 Cargile B J， Talley D L， Stephenson J L Jr. Electrophoresis， 2004， 25（6）: 936～945

13 SUI Shao-Hui， WANG Jing-Lan， JIA Wei， LU Zhuang， LIU Jin-Feng， SONG Li-Na， CAI Yun， QIAN Xiao-Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2008， 36（8）: 1017～1023

隋少卉， 王京蘭， 賈 偉， 盧 莊， 劉金鳳， 宋麗娜， 蔡 耘， 錢小紅. 分析化學， 2008， 36（8）: 1017～1023

14 Xu C F， Wang H， Li D， Kong X P， Neubert T A. Anal. Chem.， 2007， 79（5）: 2007～2014

Comparison of Phosphoproteomic Separation Strategies Based on

Strong Cation Exchange Chromatography-Isoelectric Focusing Techniques



SUI Shao-Hui1， DONG Jun-Jun1， WANG Jing-Lan2， CAI Yun2， QIAN Xiao-Hong2

1（The No. 3 Department， Institute of Chemical Defence， Beijing 102205）

2（State Key Laboratory of Proteomics-Beijing Proteome Research Center-Beijing Institute of

Radiation Medicine， Beijing 102206）

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Abstract Efficient pre-purification steps for the enrichment of phosphorylated proteins or phosphopeptides are necessary for better detection of phosphorylation sites in phosphoproteomic analysis. Currently， the most common first-dimensional separation technique used is strong cation exchange （SCX）. A potential alternative to SCX-based separation is to use isoelectric focusing （IEF） as a first-dimensional separation technique， which has been demonstrated recently. In this study， we present a direct comparison between SCX and IEF based on IPG strips （IPG-IEF） for the phosphoproteomic separation. The comparison experiments discussed in this study utilized standard phosphoproteins and a real sample of HepG2 cell. Then the comparison of 18O labeling phosphopeptides′ stability under immobilized pH gradient gel （IPG）-IEF with under SCX was made. Fractions from both technique （SCX and IPG-IEF） were analyzed using the High Mass Accuracy LTQ-FTICR-MS/MS. The results demonstrate that SCX-LTQ-FT and IPG-IEF-LTQ-FT are useful in the phosphopeptides enrichment analysis on a large scale. And SCX-LTQ-FT is relative superior to IPG-IEF-LTQ-FT， whereas the 18O labeling phosphopeptides′stability under SCX-LTQ-FT is relatively poor with that under IPG-IEF-LTQ-FT. 

Keywords Phosphopeptide separation; Strong cation exchange; Isoelectric focusing; Linear ion trap-Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry-mass spectrometry

（Received 10 March 2011; accepted 23 June 2011）