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單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性， 它是人類可遺傳的變異中最常見的一種， 占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個， 甚至更多。SNP是遺傳疾病，腫瘤等疾病的主要診斷標(biāo)記物，因此，精確并靈敏地檢測SNP在DNA的診斷中起著關(guān)鍵的作用。可是目前對于SNP的檢測方法如：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）和連接酶等有著很多的缺陷，如：對SNP的識別能力差，浪費(fèi)時間，污染環(huán)境和高消費(fèi)等。因此，急需開發(fā)新的SNP檢測方法來解決這些缺點(diǎn)。

南京大學(xué)生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室徐靜娟課題組研發(fā)了一種新的電致化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測單核苷酸多態(tài)性的傳感器（Anal. Chem.，2011， DOI: 10.1021/ac2022629），該傳感器是由電極表面的CdS納米晶（NCs）膜作為電致化學(xué)發(fā)光體，然后，基于半導(dǎo)體納米晶與金屬納米粒子之間的能量轉(zhuǎn)移具有距離相關(guān)性的特點(diǎn)（Chem. Commun.，2009： 905～907），將標(biāo)記Au NPs的二倍莖結(jié)構(gòu)探針DNA連接到納米晶膜上，最后再與標(biāo)記CdTe NPs的DNA鏈雜交形成三倍莖結(jié)構(gòu)的探針DNA，如圖（A）所示。此時的Au NPs和CdTe NPs對于CdS NCs膜的ECL有著能量轉(zhuǎn)移雙猝滅作用，因此，極大地降低了背景信號值。當(dāng)基因突變的DNA（mDNA）序列作為SNP的檢測物出現(xiàn)時，三倍莖結(jié)構(gòu)的探針DNA就會被打開，標(biāo)記CdTe NPs的DNA鏈將會被取代，而Au NPs也會遠(yuǎn)離CdS NCs膜，此時ECL導(dǎo)致的Au NPs表面等離子場將會增強(qiáng)ECL信號。與此同時，溶液中的DNA引物就會在聚合酶的作用下，生成與標(biāo)記Au NPs的探針DNA 互補(bǔ)的DNA鏈，導(dǎo)致了與探針DNA結(jié)合的mDNA又會被新生成的DNA鏈替代出來，繼續(xù)去打開另一批三倍莖結(jié)構(gòu)的探針DNA。當(dāng)反應(yīng)一旦引發(fā)，相關(guān)的聚合、剪切和取代反應(yīng)就會不斷循環(huán)發(fā)生，并如此周而復(fù)始。不僅待測mDNA仍作為DNA觸發(fā)器循環(huán)作用，而且“DNA機(jī)器”所產(chǎn)生的含有mDNA序列的DNA其觸發(fā)功能與mDNA相同，而其濃度則呈幾何級數(shù)倍增，從而實(shí)現(xiàn)了ECL信號的轉(zhuǎn)換與增高。實(shí)驗(yàn)機(jī)理如圖（B）所示。

在該研究中，CdS NCs修飾的玻碳電極（GCE）在0.05 mol/L K2S2O8 （pH 8.3） 溶液中于0～－1.4 V之間進(jìn)行循環(huán)伏安掃描時，表現(xiàn)出很強(qiáng)及穩(wěn)定的ECL信號。將標(biāo)記Au NPs的二倍莖結(jié)構(gòu)探針DNA連接到納米晶膜上時，CdS NCs膜的ECL信號降低了42%，說明了Au NPs對于CdS NCs膜的ECL具有近距離能量轉(zhuǎn)移猝滅作用；而當(dāng)標(biāo)記CdTe NPs的DNA鏈與標(biāo)記Au NPs的二倍莖結(jié)構(gòu)探針DNA雜交形成三倍莖結(jié)構(gòu)的探針DNA時，CdS NCs膜的ECL信號降低了95%，這說明了CdTe NPs對CdS NCs膜的ECL具有很強(qiáng)的能量轉(zhuǎn)移猝滅作用。一旦mDNA序列作為SNP的檢測物將三倍莖結(jié)構(gòu)的探針DNA破壞，標(biāo)記CdTe NPs的DNA鏈將會被取代，而Au NPs也會遠(yuǎn)離CdS NCs膜，此時ECL導(dǎo)致的Au NPs表面等離子場將會使ECL信號比CdS NCs膜的ECL信號增強(qiáng)94%，然后在溶液中引物、聚合酶、內(nèi)切酶的等溫循環(huán)擴(kuò)大的協(xié)助下，ECL信號有了更進(jìn)一步的提高，比CdS NCs膜的ECL信號增強(qiáng)了2倍。當(dāng)這種能量轉(zhuǎn)移的三倍莖探針體系與“DNA機(jī)器”結(jié)合后，提高了對SNP檢測的選擇性和靈敏度，對mDNA的檢測限低達(dá)35 amol/L。該方法實(shí)現(xiàn)了SNP的高靈敏度檢測，并且在遺傳疾病、腫瘤等的臨床研究和診斷方面有很好的應(yīng)用前景，為研制新的高靈敏度、特異性的生物傳感器件開辟了道路。

基于等溫循環(huán)協(xié)助的標(biāo)記兩種納米粒子的三倍莖探針，該課題組研發(fā)了一種新的ECL檢測SNP的傳感器，此傳感器有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）三倍莖上標(biāo)記的CdTe NPs和Au NPs對于電極表面的CdS NCs膜的ECL產(chǎn)生雙猝滅作用，這種雙猝滅作用極大地降低了實(shí)驗(yàn)的背景信號；（2）這種三倍莖結(jié)構(gòu)的探針DNA由于其特殊的熱力學(xué)穩(wěn)定性，對于特定的目標(biāo)DNA序列有著很高的選擇性識別能力。在室溫條件下，不連續(xù)互補(bǔ)的雙鏈DNA的穩(wěn)定性要比連續(xù)互補(bǔ)的雙鏈DNA的穩(wěn)定性差，因此，與三倍莖探針DNA連續(xù)互補(bǔ)的靶DNA就會有效地破壞三倍莖探針DNA的結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致靶DNA與探針DNA的雜交。相反，這種三倍莖結(jié)構(gòu)的探針DNA的穩(wěn)定性要比含有一個堿基錯配的連續(xù)互補(bǔ)的雙鏈DNA的穩(wěn)定性好，因此，也阻止了含有一個堿基錯配的靶DNA與三倍莖探針DNA的雜交。（3）等溫循環(huán)擴(kuò)增體系不僅能夠提高SNP檢測的靈敏度，而且還可以避免由于熱循環(huán)所帶來的一些麻煩。將納米材料的能量轉(zhuǎn)移與等溫協(xié)助的三倍莖探針相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了SNP的超靈敏檢測。此方法不僅在生物的識別轉(zhuǎn)換方面打開了一個新的思路，而且還使SNP在臨床研究和診斷方面有很好的應(yīng)用前景。

磷酸化是生物體內(nèi)存在最為廣泛的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，可以發(fā)生在約30%的蛋白質(zhì)中，對各種細(xì)胞過程和生命活動如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期等起著重要的調(diào)節(jié)作用。雖然蛋白質(zhì)磷酸化已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過100年，但是由于其豐度低、動態(tài)分布范圍寬以及生物樣品的高度復(fù)雜性，對其進(jìn)行大規(guī)模分離分析一直是分析化學(xué)家的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。近20年來，隨著各種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)磷酸化分析取得了長足進(jìn)步。特別是隨著以液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為核心的“鳥槍法”蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，對蛋白質(zhì)組磷酸化進(jìn)行規(guī)模化全面分析已經(jīng)在國內(nèi)外多個實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)，在一次試驗(yàn)中即可對上萬個磷酸化位點(diǎn)同時進(jìn)行分析表征。中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所鄒漢法研究員課題組在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域做了一系列出色的工作，在國內(nèi)外產(chǎn)生較大影響。其中周厚江、葉明亮和鄒漢法等2008年9月發(fā)表的論文（J. Proteome Res.， 2008， 7: 3957～3967）名列蛋白質(zhì)組學(xué)刊物J. Proteome Res.自2008年7月以來最高引用率論文第12位；封順、葉明亮和鄒漢法等人2007年1月在蛋白質(zhì)組學(xué)刊物Proteomics發(fā)表的論文（Proteomics， 2007， 7: 351～360）入選該刊物2007～2008年度引用率最高的20篇論文。最近，他們應(yīng)邀在Anal. Chem.上撰寫了關(guān)于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的前瞻性綜述（Perspective），并探討了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)未來可能的發(fā)展方向（Anal. Chem.， 2011， 7: 8078～8085） 。

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他們認(rèn)為近年來規(guī)模化蛋白質(zhì)組磷酸化分析在磷酸化肽段/蛋白質(zhì)富集及預(yù)分級技術(shù)的進(jìn)步、磷酸化肽段質(zhì)譜裂解方式、高速掃描高質(zhì)量精度質(zhì)譜以及磷酸化肽段定性定量相關(guān)軟件都取得巨大發(fā)展，使規(guī)模化蛋白質(zhì)組磷酸化分析達(dá)到全新水平。在提高富集的特異性和回收率方面，新型固定化金屬離子親和色譜（IMAC）和金屬氧化物親和色譜（MOAC）材料的發(fā)展有效提高了磷酸化肽段富集的特異性和回收率，如一系列以磷酸酯基為配基的新型固定化金屬離子親和色譜材料（J. Proteome Res.， 2006， 5: 2431～2437; Mol. Cell. Proteomics， 2007， 6: 1656～1665; Proteomics， 2007， 7: 351～360; J. Proteome Res.， 2008， 7: 3957～3967; Anal. Chim. Acta， 2009， 636: 34～41）。檢測靈敏度和重復(fù)性的提高可通過構(gòu)建微型化和自動化的樣品預(yù)處理分析平臺來實(shí)現(xiàn)。酶反應(yīng)器（J． Proteome Res.， 2010， 9: 1279～1288）和自動化二維分析平臺（Anal. Chem.， 2010， 82: 3007～3015）在他們實(shí)驗(yàn)室都得到了很好的應(yīng)用。另外，他們發(fā)現(xiàn)多酶酶切方法也是實(shí)現(xiàn)單個磷酸化蛋白磷酸化深度分析的理想手段（Anal. Chem.， 2009， 81: 5794～5805）。與關(guān)注于規(guī)模化鑒定數(shù)據(jù)的定性蛋白質(zhì)組學(xué)不同，定量結(jié)果的準(zhǔn)確性對定量蛋白質(zhì)組學(xué)則顯得尤為重要。定量準(zhǔn)確性包括以下兩個方面的問題：（1）磷酸化位點(diǎn)定量的準(zhǔn)確性，不同磷酸化肽段可能對應(yīng)相同位點(diǎn)，在分析中定量的結(jié)果需要跟位點(diǎn)直接對應(yīng)；（2）在對比定量分析中特定磷酸化肽段含量的變化可能來自于對應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化或其磷酸化程度的變化，因此需要對磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)分別進(jìn)行準(zhǔn)確定量，并在此基礎(chǔ)上得出磷酸化的位點(diǎn)占有率。同位素標(biāo)記是現(xiàn)階段最為準(zhǔn)確的規(guī)模化蛋白質(zhì)磷酸化定量分析手段，最近，他們通過改進(jìn)定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，引入雙同位素標(biāo)記內(nèi)參，顯著提高了大規(guī)模磷酸化肽段定量的準(zhǔn)確性（Anal． Chem.， 2011， 83: 7755～7762）。

除了發(fā)展分析技術(shù)以外，蛋白質(zhì)磷酸化分析數(shù)據(jù)的處理也尤為關(guān)鍵，如對磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確定位直接關(guān)系到分析結(jié)果的正誤。針對這一問題，他們自主研發(fā)了一系列軟件用于提高磷酸化肽段鑒定的可信度和覆蓋率，并取得了很好的結(jié)果（J. Proteome Res.， 2008， 7: 1640～1649; Anal Chem.， 2010， 82: 6168～6175; J. Proteome Res.， 2010， 9: 2743～2751）。

作為一種研究得最為成熟的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，蛋白質(zhì)磷酸化分析已經(jīng)日益被應(yīng)用于闡釋各種細(xì)胞及生物體過程的內(nèi)在機(jī)理，藥物作用靶點(diǎn)的尋找以及疾病相關(guān)特異性標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)中。對于分析化學(xué)家而言，如圖1所示，如何提高蛋白質(zhì)磷酸化分析中的靈敏度、準(zhǔn)確性、回收率、特異性和準(zhǔn)確性成為下一階段急需解決的問題。