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單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性， 它是人類可遺傳的變異中最常見的一種， 占所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個， 甚至更多。SNP是遺傳疾病，腫瘤等疾病的主要診斷標記物，因此，精確并靈敏地檢測SNP在DNA的診斷中起著關鍵的作用。可是目前對于SNP的檢測方法如：聚合酶鏈式反應（PCR），滾環擴增（RCA）和連接酶等有著很多的缺陷，如：對SNP的識別能力差，浪費時間，污染環境和高消費等。因此，急需開發新的SNP檢測方法來解決這些缺點。

南京大學生命分析化學國家重點實驗室徐靜娟課題組研發了一種新的電致化學發光（ECL）檢測單核苷酸多態性的傳感器（Anal. Chem.，2011， DOI: 10.1021/ac2022629），該傳感器是由電極表面的CdS納米晶（NCs）膜作為電致化學發光體，然后，基于半導體納米晶與金屬納米粒子之間的能量轉移具有距離相關性的特點（Chem. Commun.，2009： 905～907），將標記Au NPs的二倍莖結構探針DNA連接到納米晶膜上，最后再與標記CdTe NPs的DNA鏈雜交形成三倍莖結構的探針DNA，如圖（A）所示。此時的Au NPs和CdTe NPs對于CdS NCs膜的ECL有著能量轉移雙猝滅作用，因此，極大地降低了背景信號值。當基因突變的DNA（mDNA）序列作為SNP的檢測物出現時，三倍莖結構的探針DNA就會被打開，標記CdTe NPs的DNA鏈將會被取代，而Au NPs也會遠離CdS NCs膜，此時ECL導致的Au NPs表面等離子場將會增強ECL信號。與此同時，溶液中的DNA引物就會在聚合酶的作用下，生成與標記Au NPs的探針DNA 互補的DNA鏈，導致了與探針DNA結合的mDNA又會被新生成的DNA鏈替代出來，繼續去打開另一批三倍莖結構的探針DNA。當反應一旦引發，相關的聚合、剪切和取代反應就會不斷循環發生，并如此周而復始。不僅待測mDNA仍作為DNA觸發器循環作用，而且“DNA機器”所產生的含有mDNA序列的DNA其觸發功能與mDNA相同，而其濃度則呈幾何級數倍增，從而實現了ECL信號的轉換與增高。實驗機理如圖（B）所示。

在該研究中，CdS NCs修飾的玻碳電極（GCE）在0.05 mol/L K2S2O8 （pH 8.3） 溶液中于0～－1.4 V之間進行循環伏安掃描時，表現出很強及穩定的ECL信號。將標記Au NPs的二倍莖結構探針DNA連接到納米晶膜上時，CdS NCs膜的ECL信號降低了42%，說明了Au NPs對于CdS NCs膜的ECL具有近距離能量轉移猝滅作用；而當標記CdTe NPs的DNA鏈與標記Au NPs的二倍莖結構探針DNA雜交形成三倍莖結構的探針DNA時，CdS NCs膜的ECL信號降低了95%，這說明了CdTe NPs對CdS NCs膜的ECL具有很強的能量轉移猝滅作用。一旦mDNA序列作為SNP的檢測物將三倍莖結構的探針DNA破壞，標記CdTe NPs的DNA鏈將會被取代，而Au NPs也會遠離CdS NCs膜，此時ECL導致的Au NPs表面等離子場將會使ECL信號比CdS NCs膜的ECL信號增強94%，然后在溶液中引物、聚合酶、內切酶的等溫循環擴大的協助下，ECL信號有了更進一步的提高，比CdS NCs膜的ECL信號增強了2倍。當這種能量轉移的三倍莖探針體系與“DNA機器”結合后，提高了對SNP檢測的選擇性和靈敏度，對mDNA的檢測限低達35 amol/L。該方法實現了SNP的高靈敏度檢測，并且在遺傳疾病、腫瘤等的臨床研究和診斷方面有很好的應用前景，為研制新的高靈敏度、特異性的生物傳感器件開辟了道路。

基于等溫循環協助的標記兩種納米粒子的三倍莖探針，該課題組研發了一種新的ECL檢測SNP的傳感器，此傳感器有如下優點：（1）三倍莖上標記的CdTe NPs和Au NPs對于電極表面的CdS NCs膜的ECL產生雙猝滅作用，這種雙猝滅作用極大地降低了實驗的背景信號；（2）這種三倍莖結構的探針DNA由于其特殊的熱力學穩定性，對于特定的目標DNA序列有著很高的選擇性識別能力。在室溫條件下，不連續互補的雙鏈DNA的穩定性要比連續互補的雙鏈DNA的穩定性差，因此，與三倍莖探針DNA連續互補的靶DNA就會有效地破壞三倍莖探針DNA的結構，最終導致靶DNA與探針DNA的雜交。相反，這種三倍莖結構的探針DNA的穩定性要比含有一個堿基錯配的連續互補的雙鏈DNA的穩定性好，因此，也阻止了含有一個堿基錯配的靶DNA與三倍莖探針DNA的雜交。（3）等溫循環擴增體系不僅能夠提高SNP檢測的靈敏度，而且還可以避免由于熱循環所帶來的一些麻煩。將納米材料的能量轉移與等溫協助的三倍莖探針相結合，實現了SNP的超靈敏檢測。此方法不僅在生物的識別轉換方面打開了一個新的思路，而且還使SNP在臨床研究和診斷方面有很好的應用前景。

磷酸化是生物體內存在最為廣泛的一種蛋白質翻譯后修飾，可以發生在約30%的蛋白質中，對各種細胞過程和生命活動如信號轉導和細胞周期等起著重要的調節作用。雖然蛋白質磷酸化已經發現超過100年，但是由于其豐度低、動態分布范圍寬以及生物樣品的高度復雜性，對其進行大規模分離分析一直是分析化學家的一項艱巨任務。近20年來，隨著各種蛋白質組學技術的發展，蛋白質磷酸化分析取得了長足進步。特別是隨著以液相色譜質譜聯用技術為核心的“鳥槍法”蛋白質組學的快速發展，對蛋白質組磷酸化進行規模化全面分析已經在國內外多個實驗室實現，在一次試驗中即可對上萬個磷酸化位點同時進行分析表征。中國科學院大連化學物理研究所鄒漢法研究員課題組在磷酸化蛋白質組學研究領域做了一系列出色的工作，在國內外產生較大影響。其中周厚江、葉明亮和鄒漢法等2008年9月發表的論文（J. Proteome Res.， 2008， 7: 3957～3967）名列蛋白質組學刊物J. Proteome Res.自2008年7月以來最高引用率論文第12位；封順、葉明亮和鄒漢法等人2007年1月在蛋白質組學刊物Proteomics發表的論文（Proteomics， 2007， 7: 351～360）入選該刊物2007～2008年度引用率最高的20篇論文。最近，他們應邀在Anal. Chem.上撰寫了關于磷酸化蛋白質組學發展的前瞻性綜述（Perspective），并探討了磷酸化蛋白質組學未來可能的發展方向（Anal. Chem.， 2011， 7: 8078～8085） 。

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他們認為近年來規模化蛋白質組磷酸化分析在磷酸化肽段/蛋白質富集及預分級技術的進步、磷酸化肽段質譜裂解方式、高速掃描高質量精度質譜以及磷酸化肽段定性定量相關軟件都取得巨大發展，使規模化蛋白質組磷酸化分析達到全新水平。在提高富集的特異性和回收率方面，新型固定化金屬離子親和色譜（IMAC）和金屬氧化物親和色譜（MOAC）材料的發展有效提高了磷酸化肽段富集的特異性和回收率，如一系列以磷酸酯基為配基的新型固定化金屬離子親和色譜材料（J. Proteome Res.， 2006， 5: 2431～2437; Mol. Cell. Proteomics， 2007， 6: 1656～1665; Proteomics， 2007， 7: 351～360; J. Proteome Res.， 2008， 7: 3957～3967; Anal. Chim. Acta， 2009， 636: 34～41）。檢測靈敏度和重復性的提高可通過構建微型化和自動化的樣品預處理分析平臺來實現。酶反應器（J． Proteome Res.， 2010， 9: 1279～1288）和自動化二維分析平臺（Anal. Chem.， 2010， 82: 3007～3015）在他們實驗室都得到了很好的應用。另外，他們發現多酶酶切方法也是實現單個磷酸化蛋白磷酸化深度分析的理想手段（Anal. Chem.， 2009， 81: 5794～5805）。與關注于規模化鑒定數據的定性蛋白質組學不同，定量結果的準確性對定量蛋白質組學則顯得尤為重要。定量準確性包括以下兩個方面的問題：（1）磷酸化位點定量的準確性，不同磷酸化肽段可能對應相同位點，在分析中定量的結果需要跟位點直接對應；（2）在對比定量分析中特定磷酸化肽段含量的變化可能來自于對應蛋白質表達量的變化或其磷酸化程度的變化，因此需要對磷酸化和非磷酸化蛋白質分別進行準確定量，并在此基礎上得出磷酸化的位點占有率。同位素標記是現階段最為準確的規模化蛋白質磷酸化定量分析手段，最近，他們通過改進定量實驗設計，引入雙同位素標記內參，顯著提高了大規模磷酸化肽段定量的準確性（Anal． Chem.， 2011， 83: 7755～7762）。

除了發展分析技術以外，蛋白質磷酸化分析數據的處理也尤為關鍵，如對磷酸化位點進行準確定位直接關系到分析結果的正誤。針對這一問題，他們自主研發了一系列軟件用于提高磷酸化肽段鑒定的可信度和覆蓋率，并取得了很好的結果（J. Proteome Res.， 2008， 7: 1640～1649; Anal Chem.， 2010， 82: 6168～6175; J. Proteome Res.， 2010， 9: 2743～2751）。

作為一種研究得最為成熟的蛋白質翻譯后修飾，蛋白質磷酸化分析已經日益被應用于闡釋各種細胞及生物體過程的內在機理，藥物作用靶點的尋找以及疾病相關特異性標記物的發現中。對于分析化學家而言，如圖1所示，如何提高蛋白質磷酸化分析中的靈敏度、準確性、回收率、特異性和準確性成為下一階段急需解決的問題。