離子液體雙水相溶劑浮選法分離/富集桑黃黃酮類成分

摘 要 將親水性離子液體氯化1丁基3甲基咪唑（\\Cl）和K2HPO4形成的雙水相體系與溶劑浮選結(jié)合，建立了分離/富集桑黃中總黃酮類成分的方法。考察了分相鹽的種類和用量、樣品量、溶液pH值、浮選時間和氮氣流速對浮選效果的影響，并與雙水相萃取進行比較。當浮選分相鹽K2HPO4的質(zhì)量濃度為50%、溶液pH＝9.53、離子液體的用量為3 mL、浮選時間為50 min、氮氣流速為30 mL/min時，浮選效率最佳，達到85.31%，富集倍數(shù)為8.59。離子液體雙水相溶劑浮選法浮選效率高，富集倍數(shù)大，為中草藥有效成分分離/富集提供了新方法。

關(guān)鍵詞 溶劑浮選；紫外分光光度法；離子液體； 雙水相；桑黃；總黃酮

1 引 言

桑黃（Phellinus igniarius）是一種藥用真菌，具有抗腫瘤、增強免疫及抗肝纖維化的作用\\。桑黃主要成分有黃酮類、多糖類、香豆素類等\\，其中黃酮類成分對人體內(nèi)的自由基有明顯的清除作用，是治療心血管疾病藥物的成分之一\\。目前，提取分離黃酮類成分的常用方法有：超臨界流體萃取\\、大孔吸附樹脂\\、超濾法\\、高速逆流色譜法\\等。

溶劑浮選法是一種新型分離富集技術(shù)\\。該技術(shù)已用于中藥有效成分的提取，分離效果好，操作成本低\\。離子液體（IL）是一種新型綠色溶劑\\，可與無機鹽形成性能優(yōu)越的雙水相體系，萃取條件溫和 \\。本研究將離子液體雙水相與溶劑浮選結(jié)合，對桑黃提取物中黃酮類成分進行分離富集，富集倍數(shù)大，無需捕集劑直接浮選，使用綠色溶劑離子液體降低了二次污染，富集后用紫外法檢測即可，分析成本低，結(jié)果令人滿意。 圖1 浮選裝置

Fig．1 Solvent sublation apparatus

1. 氮氣鋼瓶； 2. 緩沖瓶； 3. 流量計； 4. 浮選池。

1. Nitrogen cylinder; 2. Cushion bottle; 3. Rotameter;

4. Solvent sublation column.

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑



UV2410PC紫外分光光度計（島津公司）； PHS3C pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DHG9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ250B超聲機（昆山市超聲儀器有限公司）；LZB玻璃轉(zhuǎn)子流量計（蘇州星辰儀表有限公司）；RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；BP221S電子天平（德國塞博尼斯公司）；浮選池（自制），裝置如圖1。

楊樹桑黃（延吉市長白山特產(chǎn)經(jīng)營部）；蘆丁對照品（純度98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；氯化1丁基3甲基咪唑（純度99%，上海成捷化學(xué)有限公司）；其它試劑均為分析純。



2.2 實驗方法

2.2.1 桑黃粗提物的制備\\ 稱取桑黃粗粉1.5 g，用45 mL 70%乙醇浸泡24h，超聲20 min，抽濾，濾渣再用相同濃度和體積的乙醇超聲提取一次；合并濾液，回收乙醇，至無醇味，加水稀釋，濾除不溶性雜質(zhì)，將濾液定容至100 mL，作為桑黃粗提物溶液。

2.2.2 標準曲線的制備\\ 精密稱取蘆丁對照品25.0 mg，用70%乙醇溶解并定容于50 mL量瓶中，配成500 mg/L的對照品儲備液。分別吸取上述儲備液0.0， 0.8， 1.6， 2.4， 3.2和4.0 mL置50 mL容量瓶中，加入1% AlCl3溶液4.0 mL，搖勻，用70%乙醇定容。30 ℃水浴加熱10 min，放置20 min后，以相應(yīng)試劑為空白，在408 nm處測定吸光度值。以濃度c（mg/L）為橫坐標，吸光度A為縱坐標進行線性回歸，得A＝0.0257c＋0.0114，R2＝0.9992，結(jié)果顯示蘆丁在0～40 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 浮選工藝流程 取適量桑黃粗提物溶液置于50 mL比色管中，加入適量K2HPO4溶液，用BR緩沖液調(diào)節(jié)pH值，轉(zhuǎn)移至50 mL浮選池中，定容，加入適量離子液體，以適當?shù)牧魉偻ㄈ氲獨飧∵x。浮選結(jié)束后，靜置，待浮選池內(nèi)無微氣泡，取上層離子液體1 mL 于10 mL容量瓶中，加0.8 mL 1% AlCl3溶液，用70%乙醇定容。30 ℃水浴加熱10 min，放置20 min，以相應(yīng)試劑做空白，在408 nm波長處測吸光度。

2.2.4 雙水相萃取方法 取1 mL桑黃粗提液、2.50 mL 50% K2HPO4溶液、3 mL離子液體溶液，置10 mL離心管中搖勻，離心10 min，靜置，取上相1 mL于10 mL容量瓶中，加1% AlCl3溶液0.8 mL，用70%乙醇定容。30 ℃水浴加熱10 min，放置20 min，以相應(yīng)試劑做空白，在408 nm波長處測定吸光度。

2.2.5 浮選效率的計算

富集倍數(shù): α＝Ct/C；分配系數(shù):K＝Ct/C0；浮選效率：E＝（1－C/C0）×100%；其中E為浮選效率，C為浮選后水相中總黃酮濃度，C0為浮選前水相中總黃酮濃度，Ct為浮選后上相中總黃酮的濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 浮選條件的優(yōu)化

3.1.1 分相鹽的選擇及加入量 考察了K2CO3， K2HPO4， K3PO4， KOH， （NH4）2SO4，K2SO4， KCl， NaCl等多種鹽與\\Cl的分相情況。結(jié)果表明，K2CO3， K2HPO4， K3PO4， KOH與\\Cl能形成雙水相，其分相能力為K2HPO4≈K2CO3≈K3PO4＞KOH，其中K2HPO4分相迅速，界面清晰。本研究選擇K2HPO4作為分相鹽。 分別配制質(zhì)量濃度為40%～55% K2HPO4溶液，考察其用量對浮選結(jié)果的影響（圖2）。隨著K2HPO4濃度增加， 圖2 分相鹽濃度的影響?yīng)?/p>

Fig．2 Effect of concentration of K2HPO4 on flotation浮選率也增大，50% K2HPO4的浮選效果最好，這是因為隨著K2HPO4濃度的增加，HPO2－4對黃酮類成分的鹽析作用增加，使黃酮類成分富集于離子液體相的量增加；當K2HPO4濃度繼續(xù)增加，出現(xiàn)過飽和現(xiàn)象，浮選率反而下降。



3.1.2 離子液體用量的影響 離子液體密度一般在1.1～1.6 g/cm3之間，粘度比一般的有機溶劑或水高1～3個數(shù)量級\\，其密度高、粘度大，使其不能直接用于溶劑浮選。本研究將離子液體用水稀釋至50%后再用于浮選；考察了離子液體用量的影響，分別加入1， 2， 3， 4和5 mL的離子液體進行氣浮溶劑浮選。結(jié)果表明，離子液體溶液的體積為3 mL的浮選效果最好。離子液體小于3 mL時，隨著離子液體用量的增加，浮選效率也增加，當超過3 mL后，浮選效率增加不明顯。本研究中離子液體用量選擇為3 mL，效率高，且經(jīng)濟。

3.1.3 桑黃粗提物溶液的影響 考察了桑黃粗提物溶液在0.5～2.5 mL范圍內(nèi)，對浮選結(jié)果的影響。實驗表明，桑黃粗提物溶液對浮選效率影響不大，本研究選擇1 mL桑黃粗提物溶液。

3.1.4 溶液pH值的影響 用BR緩沖溶液液調(diào)節(jié)溶液pH值，在pH 7.23～10.50范圍內(nèi)考察了溶液酸度對浮選結(jié)果的影響（圖3）。在pH≈9.53，雙水相分相完全，浮選效果最好；當溶液pH＜7.23時， 圖3 pH值的影響?yīng)?/p>

Fig．3 Effect of pH on flotation有鹽結(jié)晶析出，這可能是因為pH值減小，溶液中的K2HPO4與H+發(fā)生酸堿反應(yīng)，生成溶解度較低的KH2PO4，結(jié)晶析出；隨著pH值增加，浮選效率增大；但是當pH＞9.53時，浮選效率開始下降。這是因為在pH≈9.53時，樣品液中的黃酮類成分以分子狀態(tài)存在，疏水性較強，容易與上升的氣泡結(jié)合，利于被浮選到上相，而pH值繼續(xù)增加，酚羥基容易解離，親水性增加，不利于浮選。

3.1.5 浮選時間的影響 考察了浮選時間在10～70 min范圍內(nèi)變化對浮選效率的影響（圖4）。在10～50 min內(nèi)，浮選效率隨浮選時間延長而增大，當浮選時間為50 min時，浮選效率達到最大，浮選基本達到平衡；若繼續(xù)增加浮選時間，浮選效率變化不大，因此本實驗浮選時間選擇為50 min。

3.1.6 氮氣流速的影響 考察氮氣流速（10～50 mL/min）對溶劑浮選效率的影響（圖5）。隨著氮氣流速的提高，浮選效率提高。當流速為30 mL/min時，浮選效率達到最高；但是繼續(xù)增加流速，浮選效率卻隨之下降。這是因為，在一定范圍內(nèi)，提高氮氣流速有利于提高黃酮類分子與氣泡的結(jié)合面積和接觸時間，故浮選效率升高;當?shù)獨饬魉俪^某個臨界值時，大部分氣泡將沿器壁上升，破裂，氣泡上攜帶的黃酮類分子直接脫落下來，而不是進入上相，從而不利于浮選進行。故本實驗選擇氮氣流速為30 mL/min。

3.2 浮選效果評價

通過上述優(yōu)化實驗，可確定桑黃黃酮類成分的最佳浮選條件為：K2HPO4的質(zhì)量濃度為50%、溶液pH＝9.53、離子液體的加入量3 mL、浮選時間為50 min、氮氣流速30 mL/min。在最佳條件下，浮選效率為85.3%，富集倍數(shù)為8.6，分配系數(shù)為21.5。

3.3 與雙水相萃取比較

將離子液體雙水相溶劑浮選與雙水相萃取方法進行了比較，結(jié)果見表1。離子液體溶劑浮選法對桑黃總黃酮的分離富集效果明顯優(yōu)于雙水相萃取法。離子液體雙水相萃取采用環(huán)境友好的離子液體替代形成雙水相的高聚物，但萃取過程仍受相比控制、富集倍數(shù)低；而離子液體雙水相溶劑浮選不受相比控制、富集倍數(shù)高、選擇性好。本方法為中草藥有效成分的分離/富集分析提供了新方法。

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Separation/Richment Total Flavonoids in Phellinus Igniarius by

Ionic Liquid/Salt Aqueous Twophase Flotation



GE YanRu1， PAN Ru1， FU HaiZhen1， WU Yun1， FU WenYan1， YAN YongSheng2， QI XueYong*1



1（School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013）

2（College of Chemistry and Chemical Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013）

Abstract Ionic liquid/salt aqueous twophase flotation coupled with UV spectrophotometry was developed for the separation/enrichment and analysis of total flavonoids in Phellinus igniarius（Sanghuang）. The method was combined with ionic liquid aqueous twophase system based on ionic liquid （1butyl3methylimidazolium chloride， \\Cl） and inorganic salt（K2HPO4） with solvent sublation. The effect on the flotation efficiency was studied. The best conditions were as follows: the concentration of K2HPO4 was 50%; pH of solution was 9.53; the amount of \\Cl was 3 mL; the flotation time was 50 min; the nitrogen flow rate was 30 mL/min. The flotation efficiency was 85.31%， the enrichment factor was 8.59. These values are higher and larger than those of twophase extraction. The method is suitable for the separation and enrichment of the active ingredient of Chinese medicine.

Keywords Solvent flotation; Aqueous; twophase; Ionic liquid; Phellinus igniarius; Total flavonoids

（Received 26 July 2011; accepted 20 September 2011）