離子液體雙水相溶劑浮選法分離/富集桑黃黃酮類成分

摘 要 將親水性離子液體氯化1丁基3甲基咪唑（\\Cl）和K2HPO4形成的雙水相體系與溶劑浮選結合，建立了分離/富集桑黃中總黃酮類成分的方法。考察了分相鹽的種類和用量、樣品量、溶液pH值、浮選時間和氮氣流速對浮選效果的影響，并與雙水相萃取進行比較。當浮選分相鹽K2HPO4的質量濃度為50%、溶液pH＝9.53、離子液體的用量為3 mL、浮選時間為50 min、氮氣流速為30 mL/min時，浮選效率最佳，達到85.31%，富集倍數為8.59。離子液體雙水相溶劑浮選法浮選效率高，富集倍數大，為中草藥有效成分分離/富集提供了新方法。

關鍵詞 溶劑浮選；紫外分光光度法；離子液體； 雙水相；桑黃；總黃酮

1 引 言

桑黃（Phellinus igniarius）是一種藥用真菌，具有抗腫瘤、增強免疫及抗肝纖維化的作用\\。桑黃主要成分有黃酮類、多糖類、香豆素類等\\，其中黃酮類成分對人體內的自由基有明顯的清除作用，是治療心血管疾病藥物的成分之一\\。目前，提取分離黃酮類成分的常用方法有：超臨界流體萃取\\、大孔吸附樹脂\\、超濾法\\、高速逆流色譜法\\等。

溶劑浮選法是一種新型分離富集技術\\。該技術已用于中藥有效成分的提取，分離效果好，操作成本低\\。離子液體（IL）是一種新型綠色溶劑\\，可與無機鹽形成性能優越的雙水相體系，萃取條件溫和 \\。本研究將離子液體雙水相與溶劑浮選結合，對桑黃提取物中黃酮類成分進行分離富集，富集倍數大，無需捕集劑直接浮選，使用綠色溶劑離子液體降低了二次污染，富集后用紫外法檢測即可，分析成本低，結果令人滿意。 圖1 浮選裝置

Fig．1 Solvent sublation apparatus

1. 氮氣鋼瓶； 2. 緩沖瓶； 3. 流量計； 4. 浮選池。

1. Nitrogen cylinder; 2. Cushion bottle; 3. Rotameter;

4. Solvent sublation column.

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑



UV2410PC紫外分光光度計（島津公司）； PHS3C pH計（上海精密科學儀器有限公司）；DHG9145A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；KQ250B超聲機（昆山市超聲儀器有限公司）；LZB玻璃轉子流量計（蘇州星辰儀表有限公司）；RE52旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；BP221S電子天平（德國塞博尼斯公司）；浮選池（自制），裝置如圖1。

楊樹桑黃（延吉市長白山特產經營部）；蘆丁對照品（純度98%，南京澤朗醫藥科技有限公司）；氯化1丁基3甲基咪唑（純度99%，上海成捷化學有限公司）；其它試劑均為分析純。



2.2 實驗方法

2.2.1 桑黃粗提物的制備\\ 稱取桑黃粗粉1.5 g，用45 mL 70%乙醇浸泡24h，超聲20 min，抽濾，濾渣再用相同濃度和體積的乙醇超聲提取一次；合并濾液，回收乙醇，至無醇味，加水稀釋，濾除不溶性雜質，將濾液定容至100 mL，作為桑黃粗提物溶液。

2.2.2 標準曲線的制備\\ 精密稱取蘆丁對照品25.0 mg，用70%乙醇溶解并定容于50 mL量瓶中，配成500 mg/L的對照品儲備液。分別吸取上述儲備液0.0， 0.8， 1.6， 2.4， 3.2和4.0 mL置50 mL容量瓶中，加入1% AlCl3溶液4.0 mL，搖勻，用70%乙醇定容。30 ℃水浴加熱10 min，放置20 min后，以相應試劑為空白，在408 nm處測定吸光度值。以濃度c（mg/L）為橫坐標，吸光度A為縱坐標進行線性回歸，得A＝0.0257c＋0.0114，R2＝0.9992，結果顯示蘆丁在0～40 mg/L濃度范圍內線性關系良好。

2.2.3 浮選工藝流程 取適量桑黃粗提物溶液置于50 mL比色管中，加入適量K2HPO4溶液，用BR緩沖液調節pH值，轉移至50 mL浮選池中，定容，加入適量離子液體，以適當的流速通入氮氣浮選。浮選結束后，靜置，待浮選池內無微氣泡，取上層離子液體1 mL 于10 mL容量瓶中，加0.8 mL 1% AlCl3溶液，用70%乙醇定容。30 ℃水浴加熱10 min，放置20 min，以相應試劑做空白，在408 nm波長處測吸光度。

2.2.4 雙水相萃取方法 取1 mL桑黃粗提液、2.50 mL 50% K2HPO4溶液、3 mL離子液體溶液，置10 mL離心管中搖勻，離心10 min，靜置，取上相1 mL于10 mL容量瓶中，加1% AlCl3溶液0.8 mL，用70%乙醇定容。30 ℃水浴加熱10 min，放置20 min，以相應試劑做空白，在408 nm波長處測定吸光度。

2.2.5 浮選效率的計算

富集倍數: α＝Ct/C；分配系數:K＝Ct/C0；浮選效率：E＝（1－C/C0）×100%；其中E為浮選效率，C為浮選后水相中總黃酮濃度，C0為浮選前水相中總黃酮濃度，Ct為浮選后上相中總黃酮的濃度。

3 結果與討論

3.1 浮選條件的優化

3.1.1 分相鹽的選擇及加入量 考察了K2CO3， K2HPO4， K3PO4， KOH， （NH4）2SO4，K2SO4， KCl， NaCl等多種鹽與\\Cl的分相情況。結果表明，K2CO3， K2HPO4， K3PO4， KOH與\\Cl能形成雙水相，其分相能力為K2HPO4≈K2CO3≈K3PO4＞KOH，其中K2HPO4分相迅速，界面清晰。本研究選擇K2HPO4作為分相鹽。 分別配制質量濃度為40%～55% K2HPO4溶液，考察其用量對浮選結果的影響（圖2）。隨著K2HPO4濃度增加， 圖2 分相鹽濃度的影響

Fig．2 Effect of concentration of K2HPO4 on flotation浮選率也增大，50% K2HPO4的浮選效果最好，這是因為隨著K2HPO4濃度的增加，HPO2－4對黃酮類成分的鹽析作用增加，使黃酮類成分富集于離子液體相的量增加；當K2HPO4濃度繼續增加，出現過飽和現象，浮選率反而下降。



3.1.2 離子液體用量的影響 離子液體密度一般在1.1～1.6 g/cm3之間，粘度比一般的有機溶劑或水高1～3個數量級\\，其密度高、粘度大，使其不能直接用于溶劑浮選。本研究將離子液體用水稀釋至50%后再用于浮選；考察了離子液體用量的影響，分別加入1， 2， 3， 4和5 mL的離子液體進行氣浮溶劑浮選。結果表明，離子液體溶液的體積為3 mL的浮選效果最好。離子液體小于3 mL時，隨著離子液體用量的增加，浮選效率也增加，當超過3 mL后，浮選效率增加不明顯。本研究中離子液體用量選擇為3 mL，效率高，且經濟。

3.1.3 桑黃粗提物溶液的影響 考察了桑黃粗提物溶液在0.5～2.5 mL范圍內，對浮選結果的影響。實驗表明，桑黃粗提物溶液對浮選效率影響不大，本研究選擇1 mL桑黃粗提物溶液。

3.1.4 溶液pH值的影響 用BR緩沖溶液液調節溶液pH值，在pH 7.23～10.50范圍內考察了溶液酸度對浮選結果的影響（圖3）。在pH≈9.53，雙水相分相完全，浮選效果最好；當溶液pH＜7.23時， 圖3 pH值的影響

Fig．3 Effect of pH on flotation有鹽結晶析出，這可能是因為pH值減小，溶液中的K2HPO4與H+發生酸堿反應，生成溶解度較低的KH2PO4，結晶析出；隨著pH值增加，浮選效率增大；但是當pH＞9.53時，浮選效率開始下降。這是因為在pH≈9.53時，樣品液中的黃酮類成分以分子狀態存在，疏水性較強，容易與上升的氣泡結合，利于被浮選到上相，而pH值繼續增加，酚羥基容易解離，親水性增加，不利于浮選。

3.1.5 浮選時間的影響 考察了浮選時間在10～70 min范圍內變化對浮選效率的影響（圖4）。在10～50 min內，浮選效率隨浮選時間延長而增大，當浮選時間為50 min時，浮選效率達到最大，浮選基本達到平衡；若繼續增加浮選時間，浮選效率變化不大，因此本實驗浮選時間選擇為50 min。

3.1.6 氮氣流速的影響 考察氮氣流速（10～50 mL/min）對溶劑浮選效率的影響（圖5）。隨著氮氣流速的提高，浮選效率提高。當流速為30 mL/min時，浮選效率達到最高；但是繼續增加流速，浮選效率卻隨之下降。這是因為，在一定范圍內，提高氮氣流速有利于提高黃酮類分子與氣泡的結合面積和接觸時間，故浮選效率升高;當氮氣流速超過某個臨界值時，大部分氣泡將沿器壁上升，破裂，氣泡上攜帶的黃酮類分子直接脫落下來，而不是進入上相，從而不利于浮選進行。故本實驗選擇氮氣流速為30 mL/min。

3.2 浮選效果評價

通過上述優化實驗，可確定桑黃黃酮類成分的最佳浮選條件為：K2HPO4的質量濃度為50%、溶液pH＝9.53、離子液體的加入量3 mL、浮選時間為50 min、氮氣流速30 mL/min。在最佳條件下，浮選效率為85.3%，富集倍數為8.6，分配系數為21.5。

3.3 與雙水相萃取比較

將離子液體雙水相溶劑浮選與雙水相萃取方法進行了比較，結果見表1。離子液體溶劑浮選法對桑黃總黃酮的分離富集效果明顯優于雙水相萃取法。離子液體雙水相萃取采用環境友好的離子液體替代形成雙水相的高聚物，但萃取過程仍受相比控制、富集倍數低；而離子液體雙水相溶劑浮選不受相比控制、富集倍數高、選擇性好。本方法為中草藥有效成分的分離/富集分析提供了新方法。

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Separation/Richment Total Flavonoids in Phellinus Igniarius by

Ionic Liquid/Salt Aqueous Twophase Flotation



GE YanRu1， PAN Ru1， FU HaiZhen1， WU Yun1， FU WenYan1， YAN YongSheng2， QI XueYong*1



1（School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013）

2（College of Chemistry and Chemical Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013）

Abstract Ionic liquid/salt aqueous twophase flotation coupled with UV spectrophotometry was developed for the separation/enrichment and analysis of total flavonoids in Phellinus igniarius（Sanghuang）. The method was combined with ionic liquid aqueous twophase system based on ionic liquid （1butyl3methylimidazolium chloride， \\Cl） and inorganic salt（K2HPO4） with solvent sublation. The effect on the flotation efficiency was studied. The best conditions were as follows: the concentration of K2HPO4 was 50%; pH of solution was 9.53; the amount of \\Cl was 3 mL; the flotation time was 50 min; the nitrogen flow rate was 30 mL/min. The flotation efficiency was 85.31%， the enrichment factor was 8.59. These values are higher and larger than those of twophase extraction. The method is suitable for the separation and enrichment of the active ingredient of Chinese medicine.

Keywords Solvent flotation; Aqueous; twophase; Ionic liquid; Phellinus igniarius; Total flavonoids

（Received 26 July 2011; accepted 20 September 2011）