親和毛細管電泳法研究鋅離子與人血清白蛋白的結合反應機制

摘 要 建立了研究金屬離子與人血清白蛋白（Human serum albumin， HSA）相互作用的親和毛細管電泳（Affinity capillary electrophoresis， ACE）方法。生理條件下，構建配體（Zn2＋）受體（HSA）相互作用模型，以N，N二甲基甲酰胺（N，NDimethylformamide， DMF）為內標物，基于Scatchard方程，依據有效淌度的變化，通過非線性模擬方程計算Zn2＋HSA結合反應的表觀結合常數KB，定量表征了Zn2＋HSA相互作用的強度，并解析電泳譜圖獲得了Zn2＋HSA結合反應為一快平衡體系的結論。結果表明，建立的ACE方法簡捷、有效，Zn2＋HSA相互作用的強度與Zn2＋濃度之間存在明顯的量效關系。

關鍵詞 親和毛細管電泳；人血清白蛋白；鋅離子；有效淌度；表觀結合常數

1 引 言

金屬離子在維持生物體正常生理功能過程中發揮著不可替代的作用。人體中Zn2＋的含量僅次于鐵，它是人體不可缺少的微量元素之一，但其要發揮功效性能多需通過運輸到達靶位。血清白蛋白是人和動物血漿中含量最豐富的蛋白質，能夠與多種金屬離子結合，是儲存和轉運眾多內源性和外源性物質的重要載體。重金屬離子與血清白蛋白相互作用的研究對于理解重金屬離子在生物體內的代謝過程及生物學效應有著重要的意義。

目前，通過毛細管電泳（Capillary electrophoresis， CE）法研究金屬離子與其它小分子相互作用的報道較多，而通過CE方法研究金屬離子與生物大分子的報道甚少，主要是因為生物大分子與金屬離子的結合使其電泳淌度的變化不明顯。但CE方法的高分辨率和溶液體系更貼近生理條件的優點使研究者近年來試圖將此方法用于分析各種親和體系，由此形成了CE的一個新分支親和毛細管電泳（ACE）。ACE方法分析金屬離子與蛋白質等大分子相互作用的研究已見報道。這些工作雖然進行了探索性研究，但均考慮特異結合效應的蛋白質、肽分子體系。金屬離子與血清白蛋白分子相互作用的ACE方法研究尚少。本研究利用ACE方法研究Zn2＋HSA的結合反應機制，在不同Zn2＋濃度的運行緩沖液條件下，通過測定HSA的電泳淌度，對Zn2＋濃度和HSA的有效淌度進行非線性擬合，獲得了Zn2＋HSA的表觀結合常數。通過定量分析運行緩沖液中不同Zn2＋濃度對HSA有效淌度的影響，說明Zn2＋HSA相互作用的強度，可為同類研究提供參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

P/ACETM MDQ毛細管電泳儀、未涂層熔融石英毛細管柱（60.2 cm×50

SymbolmA@ m I.D.，有效長度50 cm）（美國BeckmanCoulter公司）；KQ250DB型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Eppendorf移液槍（上?？蠌妰x器有限公司）；ZD2型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）。

人血清白蛋白（HSA，純度≥96%，美國Sigma公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，BR）、N三（羥甲基）甲基甘氨酸（Tricine，純度≥98%）， N，N二甲基甲酰胺（DMF）均購自上海華美生物工程公司；其它試劑均為分析純；實驗用水為亞沸蒸餾去離子水。

2.2 實驗方法

2.2.1 ACE方法運行緩沖液及樣品溶液的配制 以25 mmol/L Tristricine空白緩沖液（pH 7.4）配制10.0 mmol/L ZnCl2儲備液。移取系列不同體積ZnCl2儲備液，以Tristricine緩沖液依次稀釋至所需濃度?？瞻拙彌_液及各含Zn2＋緩沖液均用0.45

SymbolmA@ m混合纖維素酯微孔濾膜過濾并脫氣5 min，待用。 

以空白緩沖液配制1.0×10－5 mol/L HSA溶液，加入適量0.5%DMF（用于檢測電滲流和遷移時間的重現性）混勻，0.45

SymbolmA@ m混合纖維素酯微孔濾膜過濾，備用。

2.2.2 Zn2＋HSA相互作用體系中HSA有效淌度的測定

不含Zn2＋運行緩沖液條件下，HSA有效淌度的測定程序：實驗前用0.1 mol/L NaOH、去離子水及空白緩沖液分別沖洗3 min；壓力進樣：2.0×103 Pa， 3 s；檢測波長：214 nm；分離電壓：25 kV；柱溫：25 ℃。含Zn2＋運行緩沖液條件下，HSA有效淌度的測定程序：實驗前用0.1 mol/L NaOH、去離子水、空白緩沖液分別沖洗3 min，隨后用含相應Zn2＋濃度的運行緩沖液沖洗5 min；其它測試程序同上。實驗中每兩次運行測定程序之間用0.1 mol/L NaOH、去離子水以及運行緩沖液分別沖洗3 min，分別測定6次，求不同運行緩沖液條件下HSA有效淌度的平均值。

3 結果與討論

3.1 Zn2＋HSA結合模型及相互作用理論方程

針對非共價鍵配體M（金屬離子）受體P（蛋白質分子）之間的相互作用體系（nM＋PMnP），所形成的結合物MnP的表觀結合常數表達式如下：

KB＝n（1）

受體P的平均電泳淌度（μ）變化值介于游離受體P（沒有配體M存在）的電泳淌度（μP）與結合物MnP的電泳淌度（μMnP）之間，其可以表示為： 

μ＝＋μP＋（1－＋）μMnP（2）

μMnP可用配體M濃度較高時測得受體P的電泳淌度（μMnP，∞）代替。

將方程式（1）帶入方程式（2），得到受體P的平均電泳淌度μ。

μ＝μP＋KBnμMnP1＋KBn（3）

在ACE方法中，一般不能直接準確獲得遷移區帶中游離態M的濃度，在配體M濃度的合理范圍內（通常配體M的濃度高于受體P濃度的10～100倍）可設定等于運行緩沖液中配體M的濃度，進而由受體P的μ值和估算結合常數Kb。當n＝1時，方程式（3）轉化為：

μ＝μP＋KBμMP1＋KB（4）

方程式（4）經過處理可轉化為如下形式：

1μ－μP＝1KB（μMP－μP）＋1μMP－μP（5）

方程式（5）為以電泳淌度表示的Scatchar線性方程式，以1/（μ－μP）對1/進行線性擬合，將所得直線的截距與斜率值相比即可得到Kb。但在實際的擬合過程中，μ與不存在線性關系，Bowser等強調通過對ACE方法測得的數據進行非線性擬合，特別在濃度合理范圍內，計算結合常數能夠降低誤差。

從式（4）可知，不同的對應不同的μ值。從電泳譜圖上，得到遷移時間，有效淌度計算公式如下：

μeff＝μapp－μeof＝LdLtV（1t－1teof）（6）

方程式（6）中，μeff是受體P的有效淌度，μapp是其表觀淌度，μeof是電滲流淌度，t是從電泳譜圖中直接測得的受體P的遷移時間，teof是DMF的遷移時間，V是毛細管兩端的外加電壓，Lt是毛細管總長，Ld是從進樣端到檢測窗口的有效長度。由式（7）計算出μeff ， 并把其作為式（5）中的μ（游離受體P的有效淌度或受體P的平均有效淌度）， 然后對進行非線性擬合更符合實際情況，所得結果更精確。因此本研究后續工作利用非線性擬合獲得Kb。 圖1 人血清白蛋白及N，N二甲基甲酰胺在不同運行緩沖液中的電泳圖

Fig．1 Electropherograms of human serum albumin （HSA） and N，Ndimethylformamide （DMF） under different concentrations of zinc ion in the running buffer

cHSA（mol/L）＝1.0×10－5， Zn2＋ concentrations （mol/L）:  ＝0;  ＝5.0×10－5;  ＝1.0×10－4. Peaks: 1. DMF （N，Ndimethylformamide）; 2. HSA （human serum albumin）．

3.2 ACE方法測定Zn2＋HSA的表觀結合常數

按2.2.2實驗測定Zn2＋HSA相互作用中HSA的有效淌度，結果見圖1。在不同運行緩沖液條件下， DMF與HSA混合進樣后得到毛細管電泳圖譜。其中峰1為DMF，峰2為HSA。

從圖1可見，pH 7.4時，中性內標物DMF的遷移時間基本不變，Zn2＋濃度增大不能顯著影響DMF的遷移行為，即DMF與Zn2＋之間沒有明顯的相互作用。HSA （pI 4.7）在pH 7.4空白緩沖液中帶負電荷，根據CE中不同電荷物質出峰時間先后順序知HSA在 DMF之后被檢測到，這與圖中出峰順序一致。由圖1還可看出，隨著運行緩沖液中Zn2＋濃度的增大，在空白緩沖液中具有固定濃度HSA的遷移時間縮短。

實驗中改變運行緩沖液中Zn2＋濃度，可獲得不同Zn2＋濃度條件下HSA及DMF的遷移時間，根據式（6）可計算不同Zn2＋濃度運行緩沖液中游離HSA有效淌度或HSA平均有效淌度，測定結果見表1。由表1可見，HSA的有效淌度與電滲流反向，而且隨著運行緩沖液中Zn2＋濃度的增加而增大，其值從－8.233×10－5 cm2/（V#8226;s）（游離HSA有效淌度）變化至－8.566×10－5 cm2/（V#8226;s），這表明Zn2＋HSA之間的相互作用逐漸增強。

以Zn2＋濃度為橫坐標，μeff為縱坐標作圖，得到Zn2＋HSA的親和曲線圖（圖2），非線性擬合結果列于表2中。從圖2可見，實驗數據點基本接近擬合曲線，HSA的有效淌度隨著運行緩沖液中Zn2＋濃度的增大而減小。實驗中也發現，當Zn2＋濃度在0.1～1.0 mmol/L之間變化時，HSA平均有效淌度緩慢增大；當Zn2＋濃度為1.0 mmol/L時，HSA峰區帶增寬、峰高降低，其平均有效淌度－8.3981×10－5 cm2/（V#8226;s）大于Zn2＋濃度為0.1 mmol/L時HSA平均有效淌度（－8.5660×10－5 cm2/（V#8226;s））。由實驗數據根據式（5）非線性擬合得到Zn2＋HSA的表觀結合常數Kb為2.19×104 L/mol，這與其它方法獲得的結果基本一致，說明非線性模擬方程可行（擬合曲線相關系數r為0.9937），可以利用ACE方法研究Zn2＋HSA相互作用。同時由于游離HSA有效淌度已知，由式（5）擬合的結果可得到Kb， 進而可計算得到μMP。以CE方法為基礎研究分子間相互作用能否獲得預期實驗結果與實驗條件有關，但強弱親和作用取決于結合常數的大小。由Kb可知，Zn2＋HSA相互作用親和力較強。

3.3 毛細管內壁吸附對金屬離子蛋白質分子相互作用的影響

ACE方法測定金屬離子蛋白質分子相互作用過程中需要特別注意毛細管內壁對待測蛋白質分子的吸附作用。本實驗采取TrisTricine緩沖液作為解決方案，而不是用其它分析方法研究金屬離子蛋白質分子相互作用時常用的TrisHCl緩沖液。Tricine是兩性氨基酸，它既保持高離子強度、縮短遷移時間、不會增加體系電導率， 又不會產生較大的電流，所以是抑制蛋白質分子吸附的有效方法。實驗中HSA濃度與緩沖液中Tricine濃度的倍數關系能夠對蛋白質分子的吸附起到一定的抑制作用，同時驗證了當兩性離子濃度為溶質的100～1000倍時，能抑制對蛋白質分子吸附的事實。

3.4 Zn2＋HSA相互作用過程中HSA有效淌度的變化

當分析物分子在電場作用下通過毛細管發生遷移時，它的電泳淌度μ由兩個主因素決定: 分析物分子的荷/質比和分析物分子所處環境中的其它化學物質。當蛋白質分子與質量相對小的帶電配體發生相互作用時，蛋白質配體的電泳淌度發生變化主要是因為其電荷發生了變化，而因為其質量發生變化導致電泳淌度的改變可以忽略不計。在運行緩沖液pH條件下，Zn2＋使結合物Zn2＋HSA所帶負電荷量減小，則隨著Zn2＋濃度的增大，HSA峰的遷移時間縮短，相對于游離HSA有效淌度（－8.233×10－5 cm2/（V#8226;s）），結合物Zn2＋HSA有效淌度（－8.723×10－5 cm2/（V#8226;s））發生了變化。這也證實Zn2＋與HSA確實發生了相互作用。

3.5 Zn2＋HSA結合反應體系的動力學特征

依據結合反應發生的快慢，可將結合體系分為快平衡（Kb數量級為104～106 L/mol）和慢平衡（Kb數量級為103 L/mol）體系。如果結合平衡速率比遷移速率慢，則金屬離子蛋白質能被檢測并出現一個單獨峰；而如果結合平衡速率相對快于游離蛋白質分子、結合物的遷移速率，那么游離蛋白質分子和結合物將難以分開，其混合成一個條帶遷移，在電泳譜圖上表現為一個寬峰。本實驗中，發生結合后的電泳譜圖峰數未增加，蛋白質分子峰無變形，表明Zn2＋HSA結合體系為快平衡體系。

3.6 本方法分析金屬離子蛋白質結合反應機制引起電泳淌度變化的其它因素

利用電泳淌度的改變測定分子間相互作用結合常數其它因素，需要扣除如溶液的粘度、離子強度等引起電泳淌度變化的影響。本實驗首先使Zn2＋濃度均遠低于空白緩沖液的濃度；其次使Zn2＋濃度在0～10 Kb－1范圍內。根據實驗求得的Kb值，計算最佳Zn2＋濃度范圍為0～4.6×10－4 mol/L，而實驗中所用Zn2＋濃度（0～1.0×10－4 mol/L）在該濃度范圍內，添加Zn2＋對運行緩沖液的粘度、離子強度基本無影響，引起HSA的有效淌度變化是Zn2＋HSA相互作用的結果。



研究結果表明，通過ACE方法定量分析Zn2＋HSA的相互作用是可行的，可以作為一種有效的技術手段。同時，建立的ACE方法也是一種研究生物大分子與生物活性分子間相互作用的有效方法。本研究可進一步豐富金屬離子與蛋白質分子相互作用的研究內容，具有實際參考意義。 

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Binding Interaction Between Zinc Ion and Human Serum

Albumin Using Affinity Capillary Electrophoresis

GUO Ming*， LIU MiMi， LI MingHui， HE Ling



（Department of Chemistry， Zhejiang Agriculture and Forestry University， Lin′an 311300）



Abstract The interaction between metal ions and human serum albumin （HSA） was investigated using affinity capillary electrophoresis （ACE） method. A model about the interaction between zinc ion as the ligand and HSA as the receptor was established under physiological conditions. The changes of effective mobility were determined for this interaction system with N，Ndimethylformamide （DMF） as internal marker. Based on the Scatchard model， a practical nonlinear simulation equation was used to calculate the apparent binding constant and the interaction binding strength between metal ion and HSA was quantificational characterized， and a conclusion about a quick balance system of the interaction between metal ion and HSA was acquired by analyzing electropherogram. It was concluded that ACE method was simple and effective and the obvious response relationship existed between the interaction strength and the concentrations of zinc ion. This work has referential meaning for understanding deeply the interaction strength between metal ion and HSA in vivo. The affinity capillary electrophoresis method can be considered valid for studying the interaction between metal ions and protein molecules.

Keywords Affinity capillary electrophoresis; Human serum albumin; Zinc ion; Effective mobility; Apparent binding constant

（Received 15 June 2011; accepted 19 September 2011）