固相萃取-高效液相色譜法同時檢測畜禽糞便中14種獸藥抗生素

摘 要 研究并優化了同時分析畜禽糞便中14種抗生素（四環素、磺胺、氟喹諾酮和大環內酯類）的加速溶劑萃取參數、固相富集凈化程序、以及高效液相色譜分離和檢測條件。結果表明，以1%乙酸（pH 2.6）作為流動相，在270 nm的檢測波長下，14種抗生素能達到基線分離。3倍信噪比下，四環素、磺胺、氟喹諾酮和大環內酯類抗生素的檢出限分別為35～90

SymbolmA@ g/kg， 12～28

SymbolmA@ g/kg， 9 ～17

SymbolmA@ g/kg及19

SymbolmA@ g/kg。加標濃度在1和10

SymbolmA@ g/g時，畜禽糞便樣品經過50%甲醇的檸檬酸鹽緩沖溶液提取，HLB固相萃取柱富集凈化后，四環素、磺胺、氟喹諾酮和大環內酯類抗生素的回收率分別達到了58%～75%和66%～83%，74%～93%和91%～101%，74%～80%和80%～88%，85%和68%，相對標準偏差分別為6.2%～10.7%和7.8%～13.6，2.6%～10.2%和4.4%～13.2%，6.1%～12.5%和8.3%～14.6%，10.6%和12.3%。采用此方法對遼寧省部分規模化養殖場的豬糞、牛糞和雞糞樣品進行了檢測。4類抗生素都有檢出，濃度范圍分別為0.75～22.34 mg/kg， 0.10～1.71 mg/kg， 0.38～4.46 mg/kg和0.23～0.35 mg/kg。

關鍵詞 畜禽糞便；抗生素；固相萃取；高效液相色譜

1 引 言

從20世紀50年代起，抗生素在畜禽養殖業中開始被普遍使用，其主要用途包括動物疾病治療、動物生長調節劑以及提高飼料利用效率等。抗生素作為藥物和非藥物對畜禽養殖業的發展起到重要作用，在很多國家的使用量也在不斷增加，以美國為例，集約化養殖場抗生素的使用量約占其抗生素年生產量的80%。大多數抗生素在動物體內吸收性差，30%～90%會以原形藥物形式排出體外。因此，大量抗生素將隨畜禽糞便進入環境，對地表水、農田土壤，甚至地下水造成污染。

不同類型的養殖場在動物生長的不同周期使用的抗生素種類不同，因此，對糞便中可能殘留的多種抗生素同時分析尤為重要。目前，用于分析抗生素的方法主要有液相串聯質譜法及高效液相色譜法。前者雖然具有更低的靈敏度，對樣品的分離度要求不高，但是存在較強的基質效應，尤其是對復雜的糞便樣品，并且儀器的使用及維護成本很高。比較而言，在滿足檢出限要求的前提下，高效液相色譜法不僅能實現很好地分離，準確進行定性和定量分析，還大大降低了分析成本。目前對糞便中抗生素的檢測分析研究中，普遍按抗生素種類建立檢測方法，不同類別抗生素則需要調整流動相和檢測器，不但加大了工作量，并且延長了分析時間。為實現多種抗生素同時分析，本研究優化了固相萃取前處理以及高效液相色譜檢測方法，建立了相對簡便、低成本、準確的多種抗生素同時分析的方法，對開展畜禽糞污多種抗生素殘留等相關研究具有重要意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent-1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；ASE300加速溶劑萃取裝置（美國Dionex公司）；Visiprep TM-DL固相萃取裝置（美國Supelco公司）；WD-12氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；HLB固相萃取柱（美國Waters公司）。

金霉素（CTC）、磺胺胍（SG）、磺胺（SA）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、磺胺二甲嘧啶（SMZ）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺氯噠嗪（SCP）、恩諾沙星（ENR）、雙氟沙星（DIF）和泰樂菌素（TYL），購于Sigma-Aldrich公司；四環素（TC）、土霉素（OTC）、諾氟沙星（NOR）、環丙沙星（CIP）和洛美沙星（LOM）購于中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈（色譜純， Fisher公司）；檸檬酸、EDTA鈉鹽、NaOH等試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

2.2 標準溶液的配制

準確稱取各種抗生素標準品10 mg，溶解于10 mL棕色容量瓶中。四環素類、磺胺類和大環內酯類抗生素用甲醇溶解，氟喹諾酮類抗生素用0.03 mol/L NaOH溶解，儲存于4 ℃冰箱中。準確移取各種單標儲備液，用棕色容量瓶配制各種濃度的混合標準液，待用。

2.3 樣品采集及前處理

在遼寧省選取規模化養豬場、養牛場及養雞場各3家，采集當天動物排泄的新鮮糞便，進行多點采樣并混合，約500 g作為代表性樣品。樣品采集后用黑色塑料袋密封，并立即存放于冰盒中冷藏存放，然后保持冷凍狀態下盡快運回實驗室，并進行冷凍干燥處理。凍干后的樣品避光保存，分析前用研缽研磨，并過2 mm篩后進行樣品前處理。

在畜禽糞便樣品中加入抗生素混合標準溶液，加標濃度分別設置為1和10

SymbolmA@ g/g，混合均勻后放置24 h，使藥物與樣品介質充分接觸，以模擬實際情況。每個處理樣品各提取、分析兩次。

在ASE萃取池中放入濾膜鋪墊，依次準確加入1 g樣品、0.5 g硅藻土和0.3 g EDTA，充分混勻。加入提取劑（50%甲醇+50%檸檬酸混合液）靜態提取5 min，循環兩次。收集提取液，加水將提取液的甲醇含量稀釋到10%以下（防止甲醇濃度過高，上柱時將目標物帶走）用于凈化。

SPE固相萃取柱使用前依次用5 mL甲醇和5 mL 0.2 mol/L檸檬酸溶液（pH 4）活化。將以上提取液以5 mL/min流速過柱，依次用10 mL 5%甲醇溶液和10 mL水沖洗HLB小柱，用10 mL二氯甲烷洗脫目標抗生素，洗脫液在氮氣下吹干至0.1 mL以下。加入1

SymbolmA@ g內標物質LOM，用甲醇-水混合溶液定容至1 mL，待測。

2.4 色譜條件

本研究采用Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5

SymbolmA@ m， Dikma公司）；流動相為乙腈（A）和1%乙酸（B），流速為0.8 mL/min；柱溫30 ℃；梯度洗脫程序：0～18 min，10% A；18～20 min，37% A；20～22 min， 80% A；22～25 min，80% A。3 結果與討論

3.1 SPE凈化過程的優化

畜禽糞便樣品基質非常復雜，含有蛋白質、碳水化合物、脂肪和各種無機組分。樣品的凈化對目標物的準確定量至關重要。目前，HLB固相萃取柱是環境樣品中抗生素前處理使用最多和效果最佳的柱子。研究顯示，HLB和SAX（陰離子交換柱）聯用對土壤中抗生素的凈化效果也非常好。但是，實驗發現HLB和SAX聯用使部分抗生素的回收率降低，可能是SAX柱持留了部分的目標物，而且聯用方法使凈化步驟成本提高。本實驗表明，單獨使用HLB柱即可有效凈化樣品。因此，凈化步驟選擇HLB小柱。

分別以二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃和甲醇為洗脫劑，進行洗脫實驗。由于甲醇的強極性和糞便基質的復雜性，純甲醇將柱體固定的大量干擾有機物和目標抗生素一起洗脫下來，使得目標物的出峰被雜質嚴重掩蓋。使用丙酮和甲醇進行洗脫時，柱體上的深色物質很快被洗脫下來，說明這兩種溶劑的極性還是過強。選擇極性略小的二氯甲烷、乙酸乙酯和四氫呋喃對部分抗生素目標物進行洗脫，四氫呋喃和乙酸乙酯的洗脫效率明顯高于二氯甲烷。但比較而言，二氯甲烷對金霉素的洗脫效率均好于乙酸乙酯和四氫呋喃，并且洗脫下來的雜質最少，色譜圖中目標物分離和檢測基本不會受到干擾。綜合考慮，選擇二氯甲烷作為洗脫劑更為合適。為了將全部目標物充分洗脫下來，洗脫體積設定為10 mL。 

3.2 檢測波長的確定

據相關研究顯示，四環素類抗生素在268和355 nm附近具有強吸收；磺胺類在270 nm附近有強吸收。所以，首先選用270 nm作為檢測波長。采用270 nm為檢測波長對4類抗生素進行檢測時發現，氟喹諾酮類和泰樂菌素也有較好的響應值。在二級陣列檢測器上，設置270 nm及附近波長進行多波長檢測分析，結果顯示，270 nm時14種抗生素的響應較強， 且分布相對均勻。因而，本研究選擇270 nm作為分析方法的檢測波長。

3.3 流動相的確定

抗生素是一類可離子化的極性有機化合物，因而流動相的pH值對抗生素物質的分離和檢測非常重要。流動相一般采用有機溶劑和緩沖液按一定比例混合。其中，最常用的有機溶劑是乙腈和甲醇，它們的紫外吸收較低。由于乙腈相對于甲醇有更低的吸光度，洗脫能力更強，黏度小，所以在同樣的流速下柱效更高、柱壓更低。

常添加的緩沖液甲酸、乙酸、磷酸和草酸被用于最佳的分離條件的優化。結果表明，乙酸和草酸作為流動相，分析物的峰形比較好，但是梯度洗脫時，草酸為流動相的色譜圖的基線隨流動相比例的變化出現較大的擾動，影響峰面積的確定。因此采用乙酸作為流動相。對緩沖液pH＞3時，隨pH值的增大，大部分抗生素物質的峰形變寬、峰高變小，保留時間延長。同時，過低的pH值會降低色譜柱使用壽命。因而，緩沖液的pH值控制在2～3范圍內。流動相采用1%乙酸（pH＝2.6）。

3.4 線性范圍、檢出限、定量限及回收率

配制濃度范圍在0.1～50 mg/L的系列混合標準溶液進行測定，分別以14種抗生素與內標物的峰面積之比對濃度作圖，得到各種抗生素目標物的內標曲線。結果顯示，在0.1～50 mg/L濃度范圍內標準曲線具有良好的線性，相關系數r均大于0.99。

儀器的檢出限為3倍信噪比時的濃度，儀器定量限為10倍信噪比時的濃度，方法定量限通過儀器定量限和方法回收率計算得到，具體結果見表1。除四環素類的3種抗生素的定量限高于100

SymbolmA@ g/kg外，其余抗生素的定量限都滿足100

SymbolmA@ g/kg的測定水平。在1及10

SymbolmA@ g/g兩個添加濃度下的回收率，除了CTC略偏低（分別為58%和66%），絕大多數目標物的回收率都在70%～100%之間。從方法的日內與日間穩定性來看，RSD基本都小于15%，重現性良好。

在優化的條件下，獲得的目標抗生素標準溶液的色譜圖如圖1。

3.5 實際糞便樣品的測定

將實際采集的豬糞、雞糞和奶牛糞便等動物糞樣冷凍干燥，過2 mm 篩后按照上述預處理方法和色譜條件進行提取并檢測，4類抗生素在3種畜禽糞便中均有不同程度檢出。四環素，磺胺，氟喹諾酮和大環內酯類四類抗生素的濃度范圍分別為0.75～22.34 mg/kg， 0.10～1.71 mg/kg， 0.38～4.46 mg/kg和0.23～0.35 mg/kg。比較而言，CTC的檢出率高于OTC和TC，但是OTC的殘留量最高。磺胺類抗生素檢出率相對較低，在豬糞、雞糞和奶牛糞便中的最高濃度分別為1.71（SMZ），0.89（SMR）和0.43（SMZ） mg/kg。氟喹諾酮類抗生素的檢出率也較高，所有樣品中至少有1種氟喹諾酮類藥物的檢出，ENR， NOR， CIP及DIF在所有糞便中的平均濃度分別為1.77，2.28，0.78 和0.71 mg/kg。大環內酯類的TYL在豬糞、牛糞和雞糞樣品中的檢出率和殘留量均低于以上3類獸藥抗生素，僅3個樣品中有檢出，濃度分別為0.23， 0.35和0.26 mg/kg。

實驗結果表明，本方法用于畜禽糞便中抗生素殘留的測定可行。方法靈敏度高、檢出限低， 并且具有較好的穩定性。

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2（Nuclear and Radiation Safety Centre， Ministry of Environmental Protection， Beijing 100082）