高效液相色譜法同時測定食品中7種非食用色素

摘 要 建立了高效液相色譜法同時測定食品中7種非食用色素（堿性嫩黃O、堿性橙、酸性橙Ⅱ、酸性金黃、玫瑰紅B、對位紅、蘇丹紅Ⅰ）的方法。依次采用乙腈、甲醇和堿性甲醇提取豆制品和肉制品；采用乙腈和70%乙腈依次提取調味品。采用SunFireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5

SymbolmA@ m），以甲醇50 mmol/L乙酸銨水溶液（H3PO4調至pH 4.5）為流動相，梯度洗脫，流速1 mL/min，測定波長為450和520 nm。7種非食用色素的在各自相應濃度范圍內線性相關系數均大于0.998； 檢出限（LOD）在0.01～0.1 mg/L之間； 定量限（LOQ）在0.18～1.2 mg/kg之間。平均回收率均大于80%； 相對標準偏差（RSD，n＝3）在2.0%～5.7%之間。

關鍵詞 高效液相色譜； 非食用色素; 堿性嫩黃O; 堿性橙; 酸性橙Ⅱ; 酸性金黃; 玫瑰紅B; 對位紅; 蘇丹紅Ⅰ

1 引 言

為降低成本、賦予食品誘人的外觀、穩定色澤，某些生產商在食品生產過程中違法使用非食用色素，如在辣椒粉或辣椒醬中使用蘇丹紅Ⅰ、對位紅、玫瑰紅B\\；在豆干、腐竹、腐皮中使用堿性橙、堿性嫩黃和酸性金黃\\；在鹵制熟食和軟包裝肉制品中使用酸性橙\\; 在茶葉中添加美術綠等。為此，衛生部于2008年印發了“食品中可能違法添加的非食用物質名單（第一批）”通知，列出了7種非食用色素，可見加強對食品中非食用色素的檢測十分必要。

在被非法使用的非食用色素中，以呈現紅色、黃色和橙色的非食用色素種類最多，同時使用的也最為普遍。如在“食品中可能違法添加的非食用物質名單（第一批）”中就列出了6種此類色素（蘇丹紅Ⅰ、堿性橙、玫瑰紅B、堿性嫩黃O、酸性橙、用于熟肉制品的工業染料），由于生產者隱瞞摻雜非食用色素，因而對非食用色素的分析因無法得知其化學名稱而成為檢測的難題。因此，有必要建立一種同時檢測多種非食用色素的方法，以提高分析檢測的效率。現有報道多為一種或同一類非食用色素的檢測方法，本研究選取了目前已發現用于食品中的7種非食用色素為目標檢測物，建立了同時測定的高效液相色譜方法，本方法分析快速準確。2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與樣品

高效液相色譜系統（美國Waters公司），配Waters 1525泵和Waters 2487紫外檢測器；SunFireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5

SymbolmA@ m，美國Waters公司）；KQ100DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MilliQ超純水器（美國Millipore公司）；WR2001溶劑過濾器（上海嘉鵬科技有限公司）；UV3010紫外可見分光光度計（日本日立公司）。

堿性嫩黃O（97.0%）、堿性橙（99.0%）、酸性橙Ⅱ（≥98.0%）、酸性金黃（≥98.0%）、玫瑰紅B（97.0%）、對位紅（99.0%）、蘇丹紅Ⅰ（97.0%）標準品均購于Sigma公司。乙酸銨、氨水、無水Na2SO4為分析純，甲醇和乙腈為色譜純。堿性甲醇：取10 mL氨水與490 mL甲醇混合。50 mmol/L乙酸銨溶液：準確稱取1.925 g乙酸銨，用超純水溶解，定容至500 mL，再用H3PO4調至pH 4.5。

樣品為市售包裝腐竹，豆干，真空包裝熟雞爪，包裝黃魚，辣椒醬和豆瓣醬。

2.2 色譜條件

SunFireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5

SymbolmA@ m）；流動相：甲醇50 mmol/L乙酸銨溶液（pH 4.5），梯度洗脫程序見表1；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：堿性嫩黃O、堿性橙、酸性橙Ⅱ、酸性金黃、對位紅和蘇丹紅Ⅰ為450 nm，玫瑰紅B 為520 nm；進樣量：10

SymbolmA@ L。

2.3 標準溶液配制

稱取色素標準品0.010 g，用90%（V/V）乙腈溶液溶解并定容至50 mL，配制成200 mg/L的單標儲備液。單標儲備液用90%乙腈溶液稀釋成系列濃度的混合標準工作液，繪制標準曲線。

2.4 樣品處理

豆制品與肉制品：將樣品攪碎，稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入2 mL蒸餾水潤濕樣品；用10%（V/V）氨水調節樣品至pH 7～8，加入2 g無水Na2SO4，振蕩1 min；加入10 mL乙腈提取，振蕩10 min，超聲10 min，4000 r/min離心5 min；將上清液移入25 mL容量瓶中，向殘渣中再加入5 mL甲醇，振蕩10 min，超聲10 min， 4000 r/min離心5 min；合并上清液移，再向殘渣中加入10 mL堿性甲醇，振蕩、超聲和離心，合并上清液；用甲醇定容至25 mL；過0.2

SymbolmA@ m濾膜，供HPLC分析。

調味品：稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入2 mL蒸餾水潤濕樣品；用10%（V/V）氨水調節樣品至pH 7～8，加入2 g無水Na2SO4，振蕩1 min；加入10 mL乙腈提取，振蕩10 min，超聲10 min，4000 r/min離心5 min；將上清液移入25 mL容量瓶中，向殘渣中加入15 mL 70%（V/V）乙腈溶液，振蕩10 min，超聲10 min，4000 r/min離心5 min；合并提取液，用甲醇定容至25 mL；過0.2

SymbolmA@ m濾膜，供HPLC分析。

3 結果與討論

3.1色譜條件的優化

3.1.1 波長的選擇 對7種非食用色素進行全波長掃描，各自最大吸收波長分別為：堿性嫩黃O 435 nm、堿性橙417 nm、酸性橙Ⅱ 480 nm、酸性金黃480 nm、玫瑰紅B 520 nm、對位紅484 nm、蘇丹紅Ⅰ477 nm。

分別采用450、480和520 nm同時檢測7種非食用色素，結果表明，除玫瑰紅B外，其余6種非食用色素在450 nm下的響應值較高，能獲得較低的檢出限；而玫瑰紅B則選用其最大吸收波長520 nm進行檢測。

3.1.2 流動相的選擇

采用梯度洗脫，分別比較了甲醇水、甲醇0.3%（V/V）甲酸，以及甲醇50 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，對7種非食用色素分離效果的影響。結果表明，以甲醇水為流動相時，有些物質峰缺失，不能進行有效洗脫；以甲醇0.3%（V/V）甲酸為流動相時，堿性嫩黃O、堿性橙同時洗脫，酸性橙Ⅱ、酸性金黃和玫瑰紅B同時被洗脫，不能實現有效分離；以甲醇乙酸銨溶液為流動相時，分離效果好，各物質分離度均大于1.5，且峰型較好。

3.1.3 流動相中乙酸銨濃度及pH值的影響 為了使7種非食用色素獲得更好的分離，對流動相中乙酸胺的濃度和pH值進行了優化。

分別選用25， 50和100 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，結果表明，乙酸銨溶液濃度為50和100 mmol/L時，各物質的響應值高于25 mmol/L。為避免乙酸胺在高濃度有機相中析出，本研究選用50 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相。

比較了50 mmol/L乙酸銨溶液在pH值為3.5，4.5，5.5和6.5（用H3PO4調節）對7種非食用色素的分離情況。結果表明，當pH＝4.5時，各物質峰有較好的分離度，并獲得較高的響應值。

3.1.4 標準曲線、線性范圍和檢出限（LOD） 采用上述確定的最佳色譜條件分析7種非食用色素，獲得的色譜圖見圖1。從圖1可見，7種非食用色素得到了良好的分離，且在23 min內完成檢測。

圖1 7種非食用色素色譜圖

Fig．1 Chromatogram of seven inedible pigments

1. 堿性嫩黃O; 2. 堿性橙; 3. 酸性橙Ⅱ; 4. 酸性金黃; 5. 玫瑰紅B; 6. 對位紅; 7. 蘇丹紅Ⅰ。

1. Auramine O； 2. Basic orange；3. Acid orangeⅡ； 4. Acid golden yellow G；5. Rhodamine B；6. Para Red；7. SudanⅠ.

對位紅的濃度為0.04， 0.05， 0.1， 0.5和1.0 mg/L，堿性橙的濃度為0.05， 0.1， 0.2， 0.5和1.0 mg/L，蘇丹紅Ⅰ和堿性嫩黃O的濃度為0.1， 0.2， 0.5， 1.0和1.5 mg/L，酸性橙Ⅱ的濃度為0.2， 0.5， 1.0， 1.5和2.0 mg/L，酸性金黃和玫瑰紅B的濃度均為0.25， 0.5， 1.0， 1.5和2.0 mg/L的7種非食用色素的混合標準工作液，以各濃度峰面積Y對相應濃度X繪制標準曲線，結果見表2。對位紅濃度在0.04～1.00 mg/L范圍內有良好的線性關系，蘇丹紅Ⅰ在0.10～1.50 mg/L范圍內有良好的線性關系，其余5種非食用色素在0.25～2.00 mg/L范圍內有良好的線性關系，R2均大于0.998。

以信噪比S/N＝3計算7種非食用色素的檢出限LOD，從表2可知，7種非食用色素的檢出限在0.01～0.10 mg/L之間。

3.2 樣品前處理方法的優化

提取非食用色素的溶劑有乙腈、甲醇、堿性甲醇、乙醇和丙酮\\。本研究發現，單獨使用一種提取劑同提取7種非食用色素的提取效果差，回收率低；其中乙醇和丙酮的提取液雜質較多，影響目標峰的判斷；甲醇和乙腈對堿性橙的回收率偏低；而堿性甲醇和70%乙腈溶液則有利于堿性橙的提取。通過比較，確定豆制品和肉制品的提取液為乙腈甲醇堿性甲醇；調味品的提取液為乙腈70%乙腈溶液。

在樣品前處理過程中，在提取劑中加入無水Na2SO4，以除去樣品中多余的水分; 溶液調至pH 7～8，是為了所有色素都處于同一個穩定的pH環境中，這有利于目標物的提取及提高方法的穩定性。

3.3 加標回收率、相對標準偏差及最低定量限（LOQ）

在5.0 g空白鹵雞爪樣品中添加適量7種非食用色素標準混合液，每個添加量平行3份，進行加標回收率實驗，回收率、相對標準偏差和LOQ見表3。

結果表明，3份平行樣品中，7種非食用色素的平均回收率均大于80%；相對標準偏差在2.0%～6.2%之間；7種非食用色素的LOQ分別為：堿性嫩黃O 0.50 mg/kg、堿性橙0.25 mg/kg、酸性橙Ⅱ1.00 mg/kg、酸性金黃1.25 mg/kg、玫瑰紅B 1.25 mg/kg、對位紅0.18 mg/kg、蘇丹紅Ⅰ0.50 mg/kg。

3.4 實際樣品分析

采用本方法對市售的調味品（包括辣椒粉、豆瓣醬）、肉制品（雞爪、黃魚）、豆制品（包括豆干、腐竹）中的非食用色素進行了檢測，結果見表4和圖2。即食豆干和2個腐竹樣品未檢出非食用色素。從表4可見，在7種非食用色素中，除未檢測出酸性金黃外，其余6種非食用色素在不同食品中均有檢出，有些食品還檢測出2種非食用色素。

分析結果表明，建立的7種非食用色素的HPLC方法，在23 min內即可完成7種非食用色素的同時檢測。本方法具有快速、簡便、檢測效率高、實用性強等特點。

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Determination of Seven Inedible Pigments in Food Using

High Performance Liquid Chromatography



FAN WenRui， WU Qing*， LAO Yang， LU YuShan

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（College of Food Science， South China Agricultural University，

Food Quality and Safety Key Laboratory of Guangdong Province， Guangzhou 510642）



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Abstract A method for the simultaneous determination of seven inedible pigments （Auramine O， Basic orange， Acid orangeⅡ， Acid golden yellow G， Rhodamine B， Para Red， SudanⅠ） in food was developed using high performance liquid chromatograph with ultravioletvisible detector. Acetonitrile， methanol and basic methanol were used to extract the inedible pigments from bean and meat products. Acetonitrile and 70% acetonitrilewater were used to extract the inedible pigments from condiments. Using SunFireTM C18 （250 mm×4.6 mm， 5

SymbolmA@ m）， methanol50 mmol/L ammonium acetate （adjust pH to 4.5 with phosphoric acid） as the mobile phase with a gradient elution at the rate of 1 mL/min and detected at the wavelength of 450 and 520 nm. The linear ranges of seven inedible pigments were well with correlation coefficient above 0.998. The limit of detection （LOD） of seven inedible pigments was 0.01 mg/L to 0.1 mg/L and the limit of quantification （LOQ） was 0.18 mg/kg to 1.25 mg/kg. The average recoveries of seven inedible pigments were above 80%.The RSD（n＝3） was from 2.0% to 5.7%. 

Keywords High performance liquid chromatography; Inedible pigments; Auramine O; Basic orange; Acid orangeⅡ; Acid golden yellow G; Rhodamine B; Para red; SudanⅠ

（Received 28 March 2011; accepted 11 October 2011）