基于CdSe-CdTe量子點能量轉移熒光猝滅法測定前列腺抗原

摘 要 研究了CdSe-CdTe量子點間發生的熒光共振能量轉移，并用于熒光猝滅法測定超痕量前列腺抗原（PSA）。在pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液中，CdSe-CdTe間發生有效能量轉移，使CdTe熒光大大增強。PSA抗原與CdTe標記的PSA抗體發生特異性反應，使能量轉移體系的CdTe上的熒光強度降低，即發生猝滅。建立了CdSe-CdTe能量轉移熒光猝滅法測定PSA抗原的方法。在優化的實驗條件下，PSA抗原的線性范圍為0.28～10

SymbolmA@ g/L， 相關系數r＝0.9992，檢出限達1.5×10－2 

SymbolmA@ g/L（n＝11）。

關鍵詞 量子點； 共振能量轉移； 熒光猝滅法； 前列腺抗原； CdSe； CdTe

1 引 言

熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）是指在兩個不同的熒光基團中，若一個熒光基團（供體Donor）的發射光譜與另一個基團（受體Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，兩個熒光基團間的距離合適時（一般小于10 nm），即可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現象。

量子點（Quantumdots，QDs）是直徑約為2～20 nm，能夠接受激發光產生熒光的半導體納米顆粒。傳統的FRET研究主要集中于有機熒光分子類，作為一種新型FRET試劑，QDs具有許多有機熒光分子不具備的優點，如有可調諧的激發波， 抗漂白性， 同時連接多個染料分子、狹窄的激發波長和遠離激發峰激發等優良的光學性質。因此，QDs可以成為比有機熒光分子更好的FRET的供體或受體。近年來，QDs作為供體的FRET已被廣泛報道。研究表明，量子點也可以作為FRET受體，為同時使用不同量子點作為FRET供體和受體， 建立新型的FRET提供了理論依據。目前，這方面的研究尚處于起始階段，相關報道較少。

熒光能量轉移體系發光強度大，靈敏度高，方法簡單。本研究將CdSe-CdTe能量轉移體系應用于PSA測定。詳細研究了其能量轉移規律，計算了熒光共振能量轉移相關參數，建立了CdSe-CdTe能量轉移熒光猝滅法測定超痕量PSA抗原的靈敏方法。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光光度計（日本島津公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；FA1004型電子分析天平（上海市天平儀器廠）； pHS-3C精密pH計（上海雷磁儀器廠）。

人前列腺游離PSA抗原，鼠抗人前列腺PSA單克隆抗體（桂林英美特生物技術有限公司）；CdCl2、巰基乙酸、碲粉、NaBH4、1-乙基-3（二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、NaOH等試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 水溶性量子點的合成 （1）CdSe水溶性量子點的制備 參考文獻并做適當修改，在三口燒瓶中加入3 mL蒸餾水，通氮氣2～3 min除氧。然后分別加入0.04 g Se粉，0.12 g NaBH4，停止通氮，塞住瓶口，置于冰浴中反應2 h，得到無色的澄清溶液NaHSe。在氮氣保護下，在100 mL 0.0025 mol/L CdCl2溶液中加入0.1 mL巰基乙酸，調節pH≈9，繼續通氮除氧30 min，并在攪拌下迅速加入3 mL NaHSe溶液，繼續于90 ℃下加熱攪拌回流2.5 h，即得CdSe水溶性量子點。（2）CdTe水溶性量子點的制備 參考文獻并做適當的修改，稱取0.048 g Te粉和0.12 g KBH4于三口燒瓶中，混勻，加入2 mL水，在65 ℃水浴和磁力攪拌下反應20 min，直至黑色Te粉完全消失，得到紫色透明的0.2 mol/L KHTe溶液，備用。在氮氣的保護下，在200 mL 0.0025 mol/L CdCl2水溶液中，加入0.1 mL巰基乙酸，調節pH≈10，在強磁力攪拌下，繼續通氮氣除氧30 min，迅速加入2 mL KHTe溶液，繼續于95 ℃下加入攪拌回流2 h，即獲得顏色透明的CdTe水溶性量子點。

2.2.2 PSA抗體的標記 參照文獻，取上述制備的CdTe溶液20 mL于錐形瓶中，加入0.0005 g EDC，0.0006 g NHS，200

SymbolmA@ L PSA抗體，置于30 ℃搖床中避光振蕩1.5 h，即得到標記了PSA抗體的CdTe水溶性量子點，備用。

2.2.3 CdSe-CdTe量子點間的熒光共振能量轉移（FRET）現象的研究 分別測兩種量子點的紫外吸收光譜和熒光發射光譜，觀察受體的紫外吸收光譜和供體的熒光發射光譜重疊程度；再分別測CdSe， CdTe和CdSe-CdTe混合物反應體系的熒光發射光譜，研究兩者間的熒光共振能量轉移現象，即保持CdSe（或CdTe）濃度不變，逐漸增加CdSe（或CdTe）濃度，觀察CdTe（或CdSe）熒光強度的變化。

2.2.4 CdSe和CdTe量子產率的估算 于3支5 mL比色管中，分別加入適量CdSe、CdTe和參比標準物質羅丹明B，以Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）稀釋至刻度，搖勻。于λex＝370 nm，λem＝390 nm處，測定熒光強度IF。儀器的激發和發射光譜帶寬均為15 nm。

2.2.5 熒光共振能量轉移效率的測定 于5 mL比色管中，加入適量CdSe和CdTe，以Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）稀釋至刻度，搖勻。于λex＝370 nm，λem＝390 nm處，測定熒光強度IF。儀器的激發和發射光譜帶寬均為15 nm。

2.2.6 CdSe-CdTe能量轉移體系測定PSA抗原的研究 于一系列5 mL比色管中，依次加入0.1 mL CdSe，0.2 mL CdTe，不同量的PSA抗原，以Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）稀釋至刻度，搖勻。靜置反應30 min后，于λex＝370 nm， λem＝390 nm處，測定熒光強度IF。儀器的激發和發射狹縫光譜帶寬均為15 nm。

3 結果與討論

3.1 標記PSA的CdTe的表征

由PSA抗體與標記了CdTe的PSA抗體溶液的紫外吸收光譜（圖1）可見，與標記前PSA溶液的紫外吸收光譜比較，280 nm處蛋白的吸收峰變小，證明PSA標記到了量子點上。圖2為CdTe量子點溶液和CdTe-PSA標記物溶液的發射光譜，標記前CdTe量子點溶液的發射峰比CdTe-PSA標記物溶液的發射峰發生了紅移。而CdTe與CdTe-PSA發射譜的半峰寬基本不變，表明在標記過程中量子點之間沒有發生團聚，分散性較好。

3.2 CdSe-CdTe量子點間的熒光共振能量轉移

CdSe的熒光光譜和CdTe的吸收光譜如圖3所示。給體的發射光譜和受體的吸收光譜有相當程度的光譜重疊是分子間發生能量轉移的必要條件之一。由圖3可知，CdSe的發射光譜，CdTe的吸收光譜有較好的重疊， 這為它們發生能量轉移提供了前提條件。其中CdSe是作為能量給予體，而CdTe則作為能量受體。為保證能量轉移效果，選用390 nm激發混合體系，既可以保證CdTe有較大的吸收，同時CdSe又不會被激發。體系中給體CdSe發生了熒光猝滅，將能量有效轉移到受體CdTe，使CdTe的熒光顯著增強，說明在CdSe-CdTe之間發生了熒光共振能量轉移，如圖4所示。

為進一步研究CdSe-CdTe間的能量轉移體系，固定CdTe濃度不變，逐漸增加CdSe的濃度，得到體系熒光光譜。如圖5所示，隨CdSe濃度的增加，CdTe的熒光逐漸增強。固定CdSe濃度不變，逐漸增加CdTe的濃度，得到體系熒光光譜。如圖6所示，隨CdTe濃度的增加，CdSe的熒光逐漸猝滅。進一步說明CdSe-CdTe發生了有效的能量轉移。

3.3 CdSe和CdTe量子產率

參考文獻，通過比較在相同激發條件下所獲得的待測熒光試樣和已知量子產率的參比熒光標準物質兩種稀溶液的積分熒光強度（即校正熒光光譜所包括的面積）以及這一相同激發波長的入射光（紫外-可見光）的吸光度，再將這些值分別代入公式（1），計算后可獲得待測熒光試樣的量子產率。

Φu＝ΦsFuAsFsAu（1）

式中， Φu和Φs為待測物質和參比標準物質的熒光量子產率；Fu和Fs為待測物質和參比物質的積分熒光強度；Au和As為待測物質和參比物質在該激發波長的入射光的吸光度（A＝εbc）。本研究采用羅丹明B（RhB）溶液作參比熒光標準物質。根據文獻報道RhB量子產率為0.89，本方法測得CdSe量子產率為0.34。同上計算得出CdTe的量子產率為0.26。

3.4 熒光共振能量轉移效率

參考文獻，根據Frster非輻射能量轉移機制，其能量轉移效率與給體-受體之間的距離（r）及臨界能量轉移距離（R0）有關，給體與受體之間能量轉移效率E為：

E＝R60R60＋r6（2）

式中，R0是轉移效率為50%時的臨界距離：

R60＝8.8×10－25K2N－4ΦJ（3）

式中，K2為偶極空間取向因子，N為介質的折射率，Φ為給體的熒光量子產率，J為給體的熒光發射光譜與受體的吸收光譜之間的光譜重疊積分，即：

J＝∑F（λ）ε（λ）λ4Δλ∑F（λ）Δλ（4）

式中，F（λ）為熒光給體在波長λ處的熒光強度，ε（λ）為受體在波長λ處的摩爾吸收系數，能量轉移效率E可由下式求出：

E＝１－F/F0（5）

根據公式（2）～（5），本實驗計算的CdSe-CdTe能量轉移效率E為0.32，說明CdSe-CdTe量子點間具有較高的熒光共振能量轉移效率。

實驗表明，選用pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液， 能量轉移效果最好。CdSe-CdTe體系熒光能量的轉移效率與二者的濃度密切相關，且對CdSe-CdTe/PSA體系而言，能量轉移效率越高，免疫特異性反應猝滅CdTe的程度越大。當CCdSe/CCdTe＝4時，免疫特異性反應對CdSe-CdTe熒光猝滅效果最好。此時，體系在室溫下反應30 min即可完成，且1 h內穩定。

3.5 工作曲線

在最佳實驗條件下進行了標準曲線的繪制，如圖7所示。結果表明，PSA抗原濃度在0.28～10

SymbolmA@ g/L的范圍內與體系的熒光猝滅強度呈良好的線性關系，其線性回歸方程為ΔIF＝4.4629c＋34.853，線性相關系數r＝0.9992; 檢出限為1.5×10－2

SymbolmA@ g/L （n＝11）。按上述方法對加入4.0

SymbolmA@ g/L的PSA抗原體系進行10次平行測定，相對標準偏差為2.1%，說明具有良好的精密度。

圖7 工作曲線

Fig．7 Calibration curve

Concentration of CdSe: 6×10－8 mol/L， CdTe: 3×10－8 mol/L. Concentration of PSA（a～m）: 0.28， 0.56， 0.84， 1.12， 1.40， 1.68， 1.96， 2.24， 1.92， 5.60， 7.28， 8.40， 10.08

SymbolmA@ g/L.

3.6 干擾實驗

按照實驗方法，當PSA抗原濃度為4.0

SymbolmA@ g/L時，考察了多種常見氨基酸及其它離子對反應的干擾，結果見表1。由表1可知，氨基酸及許多金屬離子對體系基本沒有影響，說明本方法具有較好的選擇性。

3.7 樣品的測定

利用本方法對人血清（桂林醫學院附屬醫院提供）中的PSA總量進行測定，同時進行標準加入回收實驗，結果見表2。正常人血清中PSA的參考值通常為0～4

SymbolmA@ g/L，本法測定結果與之基本吻合， 結果令人滿意。CdSe-CdTe熒光能量轉移體系發光強度大，操作簡單，成本低廉，可針對不同免疫反應構建不同免疫熒光共振能量體系，擴大其臨床使用范圍。

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

Fluorescence Resonance Energy Transfer Between Quantum Dots of

CdSe and CdTe and Its Application for Determination of

Serum Prostate Specific Antigen

TAO Hui-Lin， LI Shu-Huai， Li Jian-Ping*

（College of Chemistry and Bioengineering， Guilin University of Technology， Guilin 541004）





Abstract Fluorescence resonance energy transfer （FRET） from CdSe quantum dots to CdTe quantum dots and the application for determining serum prostate specific antigen（PSA） were studied. It was found that the effective energy transfer can occur between CdSe and CdTe in the Tris-HCl buffer solution at pH＝8.0 in which the CdTe fluorescence intensity has been increased. As adding prostate specific antigen， the fluorescence intensity of CdSe-CdTe system is decreasing and finally quenching because of the specific immunological reaction between the PSA antigen and CdTe labled PSA antibody. There were good linear correlations between the concentrations of PSA antigen and the fluorescence quenched intensities. Then a new determination strategy of PSA was built by using the CdSe-CdTe system. Under optimum conditions， the linear range of determining PSA antigen was 0.28－10

SymbolmA@ g/L， with a correlation coefficient of r＝0.9992 and a detection limit of 1.5×10－2

SymbolmA@ g/L （n＝11）.

Keywords Quantum Dots; Fluorescence resonance transfer; Fluorescence quenching; Prostate specific antigen; Cadmium selenide; Cadmium telluride

（Received 25 August 2011; accepted 29 September 2011）