微乳電動毛細管色譜法分離檢測醬油中的氯丙醇

摘 要 建立了微乳電動毛細管色譜分離3種氯丙醇的方法。以十二烷基硫酸鈉（SDS）作為表面活性劑，系統(tǒng)考察了pH值、緩沖溶液類型和濃度、SDS濃度、助表面活性劑濃度、油相濃度、溫度和運行電壓對3氯1，2丙二醇（3MCPD），1，3二氯2丙醇（1，3DCP），2，3二氯1丙醇（2，3DCP）分離的影響。結(jié)果表明，最佳微乳緩沖液為1%（V/V）正庚烷，100 mmol/L SDS，10%（V/V）正丁醇和8 mmol/L磷酸二氫鈉硼砂溶液（pH 8.50），檢測波長為192 nm，溫度20 ℃，分離電壓為15 kV。3種氯丙醇的線性范圍為2.0×10－6～3.2×10－5 mol/L，相關系數(shù)大于0.996，檢出限（S/N＝3）為0.95～1.9

SymbolmA@ mol/L。醬油樣品經(jīng)乙醚液液萃取，萃取平均回收率為93.2%～103.0%，相對標準偏差小于6.5%。本方法應用于實際樣品和加標后樣品中三氯丙醇的檢測，結(jié)果滿意。

關鍵詞 微乳毛細管電動色譜法； 氯丙醇； 液液萃取； 醬油

1 引 言

食品中的氯丙醇類污染物包括3氯1，2丙二醇（3MCPD）、1，3二氯2丙醇（1，3 DCP）和2，3二氯1丙醇（2，3DCP）等3種甘油羥基氯代物，其中3MCPD含量最高，達70%。據(jù)報道，3MCPD主要毒害神經(jīng)系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)，容易誘發(fā)神經(jīng)病和心臟病，動物實驗顯示3MCPD可產(chǎn)生致癌作用，并具有遺傳毒性\\。因此氯丙醇污染已成為國際關注的食品安全問題。目前氯丙醇的形成機制還不完全清楚，已發(fā)現(xiàn)各類食品都可能存在氯丙醇污染，但主要是酸水解植物蛋白（HVP）以及含HVP的配制醬油氯丙醇污染嚴重。因此有必要研究開發(fā)多種檢測氯丙醇的新方法，以滿足日常監(jiān)控需要。

氯丙醇類化合物的檢測主要采用氣相色譜法（ECD或FID檢測）\\、GC/MS和GC/MS/MS法\\、毛細管電泳法\\和分子印記法等\\。由于氯丙醇類化合物沸點高，極性大，分子量低，采用GC或GCMS分析，特征離子少，峰形和靈敏度差，需要對其進行衍生以增加揮發(fā)性并提高靈敏度，前處理費時繁瑣。而分子印跡法（MIP）基于3MCPD與聚合物反應形成特異識別性能的電位型化學傳感器，通過測定加入醬油前后MIP的電極電位變化，檢測3MCPD的含量。分子印記法存在低含量氯丙醇與模板上功能分子結(jié)合的有效性低、基體干擾較大等問題。

毛細管電泳法（CE）具有分離效率高、分析速度快和樣品用量少等特點，但其在氯丙醇的檢測中，應用極少。謝天堯等\\利用硼酸與3MCPD上的2個鄰位羥基進行鍵合形成配合陰離子、以增加多羥基化合物的負電荷，在15 mmol/L三羥甲基氨基甲烷和210 mmol/L H3BO3 （pH 8.3） 電泳介質(zhì)中，采用毛細管電泳/電導檢測法（CE/CD）分離檢測了3MCPD。Xing等\\應用毛細管區(qū)帶電泳/電化學檢測法（CE/ECD）檢測醬油中3MCPD的含量，并考察了pH值、緩沖液的濃度和進樣時間等因素的影響，檢出限達0.13 mg/L。

采用毛細管電泳電化學檢測氯丙醇所用的分離模式多為區(qū)帶電泳，運行電解質(zhì)為pH 9.24的硼砂緩沖液。本研究根據(jù)氯丙醇類污染物的結(jié)構和溶解特性，采用微乳毛細管電泳分離分析食品中氯丙醇類污染物，同時研究復雜食品樣品的前處理技術，以提高分析結(jié)果的準確性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Backman P/ACE TM MDQ毛細管電泳系統(tǒng)。熔融石英毛細管：64 cm（有效長度55 cm）×75

SymbolmA@ m i.d.，河北永年銳灃色譜器件有限公司）。pHX450型精密離子計。固相萃取裝置（美國Supelco公司），配備3 mL固相萃取LCC18小柱，柱內(nèi)填加500 mg C18吸附劑。隔膜真空泵（天津騰達過濾器件廠）。

3氯1，2丙二醇（3MCPD）、2，3二氯1丙醇（2，3DCP）、1，3二氯2丙醇（1，3DCP）標準溶液（純度>98%，深圳市亞王康麗技術有限公司）。5種不同品牌市售醬油購自超市。SDS（Sigma 公司）。其它試劑均為分析純（廣東汕頭化學試劑廠）。實驗用水均為三次重蒸水。

2.2 緩沖體系和標準儲備液的制備

準確移取適量的正庚烷、正丁醇、SDS、NaH2PO4#8226;2H2O和水，混合，超聲30 min，得透明穩(wěn)定的溶液，用硼砂調(diào)節(jié)pH值，用水稀釋至適合的濃度。運行緩沖溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前過0.45

SymbolmA@ m濾膜，超聲脫氣1 min。

準確移取一定量的3MCPD， 1，3DCP， 2，3DCP標準溶液，用8 mmol/L微乳緩沖溶液超聲溶解，并容至100 mL，低溫保存。

2.3 樣品提取方法的選擇

2.3.1 乙醚液液萃取法 準確量取50.0 mL醬油于250 mL具塞分液漏斗中，加50.0 mL乙醚，振蕩萃取10 min，靜置分層。有機相萃取液緩慢倒入裝有適量無水Na2SO4的漏斗，過濾至小燒杯中。水相分離液用30 mL乙醚再提取2次，每次振蕩萃取5 min。合并乙醚提取液，在室溫下以氮氣吹干，用8 mmol/L微乳緩沖溶液超聲溶解至1.0 mL，過0.45

SymbolmA@ m濾膜，進樣分析。

2.3.2 固相萃取法 準確吸取2.0 mL醬油于C18固相萃取柱，放置10 min，用8.0 mL乙醚洗滌，抽干，收集全部洗脫液于小燒杯中，在室溫下，以氮氣吹至近干，用200

SymbolmA@ L 8 mmol/L微乳緩沖溶液超聲溶解，過0.45

SymbolmA@ m濾膜，進樣分析。準確吸取2.0 mL醬油于自制的硅酸鎂載體小柱中，其余操作同上。 

2.4 毛細管電泳分析

新的毛細管使用前，依次用1.0 mol/L NaOH、甲醇及水分別沖洗30，10和10 min；每天運行前依次用甲醇、水及緩沖液各沖洗5 min；加電壓15.0 kV，進行毛細管平衡處理2 min。采用壓力進樣，進樣壓力為5.52 kPa，進樣時間10 s，分離電壓為15 kV，檢測波長192 nm，儀器控制和數(shù)據(jù)采集、處理采用32 Karat 7.0軟件（Backman 公司）。每兩次運行間，毛細管只用運行緩沖溶液沖洗3 min。3 結(jié)果與討論

3.1 微乳電動毛細管色譜（MEEKC）方法的建立

根據(jù)氯丙醇類化合物的極性和溶解性，采用MEEKC法進行分離，以組成為0.81%（w/w）正庚烷，6.61%（w/w）正丁醇，3.31%（w/w）SDS，89.27%（w/w）水 和10 mmol/L 磷酸鹽溶液的標準微乳緩沖液為研究起點，進行系列的條件優(yōu)化實驗。

3.1.1 pH值的影響 緩沖溶液的pH值影響帶電粒子的狀態(tài)和電滲流（EOF）的水平，從而影響分離的選擇性。實驗表明，在pH＜7.0時，3MCPD無法被檢測出來；pH＞9.0時，無法取得良好的分離效果。因此，考察了緩沖溶液的pH值在7.0～9.0范圍內(nèi)對3種氯丙醇分離的影響（圖1）可知，pH值對遷移時間的影響不大；但pH＝8.5時的峰面積最大。綜合考慮不同pH值下的分離度、靈敏度及出峰時間，選擇pH＝8.5。

3.1.2 緩沖溶液類型和濃度的影響 考察pH 8.5，濃度均為5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，硼酸硼砂緩沖液，TrisHCl緩沖液，磷酸鹽硼砂緩沖液對分離的影響。結(jié)果表明，磷酸鹽緩沖液無法分離3種氯丙醇；而硼酸硼砂緩沖液、TrisHCl緩沖液及磷酸鹽硼砂緩沖液均能使3種氯丙醇得到較好的分離，其中在磷酸鹽硼砂緩沖液中3種氯丙醇的分離效果最好，峰面積大且出峰時間較快。本研究選擇磷酸鹽硼砂為運行緩沖液。

考察磷酸鹽硼砂緩沖液濃度（4～10 mmol/L）對分離的影響。實驗表明，當運行緩沖液濃度大于10 mmol/L時，分離效果不佳，分離度低，峰形差，且有重疊現(xiàn)象出現(xiàn)，不利于樣品的檢測；運行緩沖液濃度為6 mmol/L時，分離度較高，靈敏度也較大，但是運行時間過長且峰形不佳； 運行緩沖液濃度為8 mmol/L時，運行時間短，峰形較好。綜合考慮運行時間、分離度及峰形，本實驗中運行緩沖液濃度選擇為8 mmol/L。

3.1.3 SDS濃度的影響 SDS作為表面活性劑，其濃度對分離效果有明顯的的影響，它不僅影響油滴的帶電性大小及EOF的方向，而且影響溶質(zhì)離子對的水平。本實驗考察了SDS濃度（90～110 mmol/L）對分離的影響。結(jié)果表明，SDS濃度為90 mmol/L時，電流極不穩(wěn)定，因為低濃度的微乳穩(wěn)定性下降；SDS濃度大于110 mmol/L時，遷移時間和工作電流增加；SDS濃度為100 mmol/L時，工作電流適中、穩(wěn)定，且分離效果較好。綜合考慮微乳液的穩(wěn)定性和分離效果，SDS的濃度選擇為100 mmol/L。

3.1.4 助表面活性劑濃度和類型的影響 考察了正丁醇濃度6%～14%（V/V）對分離效果的影響。結(jié)果表明，正丁醇濃度大于10%后，溶液開始分層，且變渾濁，遷移時間增加，而且峰形不佳；當正丁醇濃度為10%時，靈敏度高，分離效果最佳。

以10%的乙醇，異丙醇或乙酸乙酯代替正丁醇，考察不同表面活性劑的影響。結(jié)果表明，用10%的乙醇，異丙醇或乙酸乙酯配制的微乳液穩(wěn)定性下降，特別是乙酸乙酯極不易乳化，檢驗靈敏度降低。本實驗采用10%正丁醇。

3.1.5 油相濃度的影響 考察1%～5%（V/V）正庚烷對分離效果的影響。結(jié)果表明，隨著正庚烷濃度的增加，黏度的增加， 遷移時間延長，因而選擇濃度為1%的正庚烷。

3.1.6 溫度的影響 由于溫度對分離效果影響比較大，在20～45 ℃范圍內(nèi)考察了溫度對分離效果的影響。升高溫度，溶質(zhì)的溶解度增大，遷移時間縮短，但是溫度的提高也降低運行緩沖液的粘度，導致較快的EOF，出峰時間縮短，分離度降低。由于高溫可引起微乳液蒸發(fā)， 圖2 氯丙醇標準混合液的電泳分離圖

Fig．2 Electropherogram of three chloropropanols in mixtrue standard solution

緩沖溶液（Buffer solution）: 1%（V/V）正庚烷 （Heptane）＋100 mmol/L SDS＋10%（V/V）正丁醇 （1Butanol）＋8 mmol/L磷酸鹽硼砂緩沖溶液 （Phosphateborax buffer solution）（pH 8.50）. 1. 3MCPD； 2. 1，3DCP； 3. 2，3DCP。

因為高溫時靈敏度降低。為了保持高的分離度、靈敏度，分離溫度選擇為20 ℃。在優(yōu)化條件下，5×10－5 mol/L 氯丙醇標準混合液的電泳分離圖見圖2。

3.2 樣品提取方法的選擇

3.2.1 提取劑的選擇 按照2.3.1節(jié)，采用液液萃取對醬油進行處理，考察乙醚、乙酸乙酯、丙酮為萃取劑對醬油中氯丙醇萃取效果的影響。實驗表明，以乙酸乙酯或丙酮萃取后，由于油相濃度高，進樣時容易堵管，不利于分離。采用乙醚萃取法結(jié)果如圖3 A所示，圖中電泳峰經(jīng)加標（圖3D）和紫外光譜圖確認。從圖3A和3D可見，采用乙醚萃取，分離效果好，無基體干擾。按照2.3.2實驗方法，分別采用C18固相萃取法\\和硅酸鎂小柱固相萃取法\\對醬油進行處理，結(jié)果如圖3B和3C所示。采用C18固相萃取法對醬油進行前處理，在氯丙醇出峰位置無干擾峰出現(xiàn)，萃取組分分離效果好。但采用硅酸鎂小柱固相萃取法對醬油進行前處理，基體干擾嚴重。比較圖3A和3B可知，由于液液萃取處理的樣品量大，富集倍數(shù)高，可靈敏檢測出氯丙醇，而C18固相萃取法處理的樣品量少，無法檢測到氯丙醇。因此本實驗采用乙醚液液萃取法進行樣品的前處理。

分析條件如圖2 （Analytical conditions were same as in Fig．2）。 （A） 乙醚液液萃取法（Ether liquidliquid extraction）； （B） C18固相萃取法（C18 solid phase extraction）；（C） 硅酸鎂固相萃取法（Magnesium silicate solid phase extraction method）；（D） 加8×10－6 mol/L氯丙醇混合標液后乙醚液液萃取 （Ether liquidliquid extraction After the addition of 8×10－6 mol/L chloropropanol mixtrue standard solution）。

3.2.2 方法的萃取回收率 采用市售某品牌醬油作為加標試樣，經(jīng)測定，該醬油中不含3MCPD， 1，3DCP， 2，3DCP。取100.0 mL醬油樣品，添加氯丙醇標準混合溶液，使其在醬油樣品中濃度達4×10－6， 8×10－6和3.2×10－5 mol/L，按2.4.1實驗步驟對醬油進行萃取和電泳分離分析，得各氯丙醇的峰面積。

另配制濃度分別為4×10－6， 8×10－6和3.2×10－5 mol/L的氯丙醇標準混合溶液，直接進行電泳分離分析。平行測定6次，以萃取峰面積與未萃取峰面積之比計算萃取回收率（表1），萃取回收率在93.2%～103.0%范圍內(nèi)，相對標準偏差小于6.5%，精密度良好，說明本方法能滿足實際樣品的測定要求。

3.3 線性方程、檢出限、精密度和準確度

采用外標法定量，氯丙醇的峰面積（Y）與其濃度（X，mmol/L）在3.20×10－5～4.00×10－6 mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系。線性回歸方程和檢出限（LOD，S/N＝3）見表2。國家規(guī)定3MCPD的

限量標準是≤1 mg/kg \\（1 mg/kg＝1 mg/L），相當于9.05×10－6 mol/L，高于本方法的檢出限，說明本方法適用于醬油中氯丙醇的檢測。

將3.2×10－5 mol/L氯丙醇混合標準溶液連續(xù)平行測定6次，每日測定1次，連續(xù)6 d，計算日內(nèi)和日間精密度及準確度，結(jié)果見表3。

3.4 醬油樣品分析

取5種不同品牌的市售醬油樣品各50.0 mL，每種品牌的醬油分成2組，其中1組加入8.0

SymbolmA@ moL/L氯丙醇混合標準溶液，進行樣品的提取和毛細管電泳分析，平行測定3次，結(jié)果表明，5種不同品牌的樣品中編號為3的市售醬油含0.2

SymbolmA@ mol/L 3MCPD，即22

SymbolmA@ g/kg。其余醬油樣品均未檢出3MCPD，

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Separation and Analysis of Chloropropanol in Soy Sauces Using

Microemulsion Electrokinetic Capillary Chromatography

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WEI ShouLian*， YAN ZiJun， LIU Ling， ZHAO JianFen

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（Faculty of Chemistry and Chemical Engineering， Zhaoqing University， Zhaoqing 526061）



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Abstract A microemulsion electrokinetic capillary chromatographic （MEEKC） method for the simultaneous separation of three chloropropanols， 3chloro1，2propanediol （3MCPD）， 1，3 dichloro2propanol （1，3DCP） and 2，3dichloro1propanol （2，3DCP）， has been developed. Using sodium dodecylsulfate （SDS） as surfactant， a systematic study of the influence of buffer pH， type and concentration of buffer solution， SDS concentration， cosurfactant concentration and oil concentration， temperature and operating voltage have been carried out. The results showed that the optimum conditions were as follows: the detection wavelength: 192 nm， temperature: 20 ℃， separation voltage: 15 kV， running buffer: 1% （V/V） heptane， 100 mmol/L SDS， 10% （V/V） 1butanol， and 8 mmol/L sodium dihydrogen phosphateborax buffer solution （pH 8.50）. The calibration curve showed a good linearity over the concentration of three chloropropanols in the range of 2.0×10－6－3.2×10－5 mol/L with a correlation coefficient more than 0.996. The detection limit （S/N＝3） ranged from 0.95 to 1.9

SymbolmA@ mol/L. Prior to electrophoresis， the soy sauce was extracted by ethe. The extraction average recoveries were 93.2%－103% with RSDs less than 6.5% （n＝6）. The method was applied to the determination of three chlorine propanols in real samples and spiked samples with satisfactory results.

Keywords Microemulsion electrokinetic capillary chromatography; Chloropropanols; Liquidliquid extraction; Soy sauce

（Received 24 May 2011; accepted 21 August 2011）