基于聚苯胺納米纖維復合膜界面構建電化學細胞傳感器及其對癌細胞的識別檢測

摘 要 合成了聚苯胺納米纖維，直徑在50～70 nm之間；基于靜電作用構建聚苯胺納米纖維-納米金復合膜界面，并在此界面上層層組裝修飾葉酸分子，構建葉酸功能化傳感界面，基于葉酸分子與癌細胞表面過量表達的葉酸受體之間的特異性識別作用，將此傳感界面應用于對癌細胞的識別和捕獲。結果表明： 葉酸功能化傳感界面能夠特異性識別和捕獲葉酸受體過量表達的癌細胞。采用電化學阻抗技術，以HeLa細胞為模型，應用于對癌細胞的識別和檢測，細胞在1.0×104～6.4×106 cells/mL濃度范圍內與阻抗變化值ΔRct呈良好的線性關系；檢出限為2000 cells/mL。本方法簡單、快速靈敏、重現性和穩定性良好；制備的傳感器可以再生使用。

關鍵詞 細胞傳感器; 聚苯胺納米纖維; 納米金; 癌細胞

1 引 言

基于電化學檢測的細胞傳感器，是通過測量電化學信號（如電流、阻抗及電容等）分析評價細胞，目前已成為生物傳感器研究領域的熱點。電化學技術可對細胞生長發育以及細胞功能變化等方面提供相關信息。近年來，一系列電化學細胞傳感器已用于對細胞的類別、濃度、活性、增殖、擴散、調亡及細胞內外分子的分布等的研究。電化學阻抗技術因其對細胞無創傷性及細胞在電極界面的高阻抗性而被用于研究細胞的生理學、形態學及細胞功能變化等。

目前，用于構建電化學細胞傳感器界面的材料主要有殼聚糖、納米金、碳納米管等生物相容性好的材料。Chen等基于鍵合生物相容性的殼聚糖（CS）和具有良好導電性的碳納米管（CNF）形成復合膜，控制電沉積形成的CS-CNF納米復合物膜具有良好的生物相容性，可用于固定K562細胞。Zhang等基于功能化碳納米管（PDCNx）、硫堇（TH）和納米金（AuNPs），通過層層組裝方式形成三維結構基底，制備了可用于評價細胞表面P-gp表達量的生物傳感器。Ding等在絲網印刷碳電極上電聚合聚苯胺，利用電聚合聚苯胺界面吸附細胞，通過測量細胞吸附后阻抗的變化研究和監測K562細胞的粘附和增殖；實驗表明，細胞可以在聚苯胺界面生長增殖，說明聚苯胺具有良好的生物相容性。目前，利用聚苯胺納米纖維（PANI-NF）作為基底材料構建電化學細胞傳感器界面尚未見報道。 圖1 葉酸的分子結構

Fig．1 Structure of folic acid（FA）

葉酸（FA），即維生素B9，是親水性的小分子，其分子結構式如圖1。葉酸受體（FR）被稱作高親和性葉酸結合蛋白，膜表面的FR可與FA特異性結合。FR在正常組織表達高度保守，而在大部分惡性腫瘤中高度表達， 有時比正常組織高100～300倍。

本研究將PANI-NF與AuNPs復合形成納米復合膜界面，在PANI-NF/AuNPs界面上層層組裝修飾上葉酸（FA），構建了新的傳感界面電化學細胞傳感器（圖2）。以PANI-NF為基底，具有高的比表面積和帶正電荷，對AuNPs有較好的吸附能力，有利于界面修飾生物分子；同時用BSA封堵傳感界面上空余的活性位點，提高傳感界面的特異性識別能力，可應用于癌細胞的識別與檢測，進一步應用于其它細胞功能性研究。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

CHI660a電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；TECNAI-10透射電鏡（TEM，美國Philips公司）； Autoprobe CP Research原子力顯微鏡（AFM，美國Thermo Microscopes公司）。

苯胺、過硫酸銨（廣州化學試劑廠），葉酸、谷胱甘肽、NHS、EDC（AR，Aldrich公司），其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4，含有8 mmol/L Na2HPO4， 1.5 mmol/L KH2PO4，137 mmol/L NaCl和27 mmol/L KCl）。

HeLa細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞庫）。人淋巴細胞和血紅細胞由健康人外周血中分離獲得。細胞培養所用培養液為RPMI1640（Sigma公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。RPMI1640培養基在使用前加入新生牛血清和雙抗儲備液（青霉素十鏈霉素），使血清的含量為10%，青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 mg/L。

2.2 復合膜修飾電極的制備

制備聚苯胺納米纖維和納米金參考文獻。取10

SymbolmA@ L 0.2 g/L PANI-NF溶液滴涂在新鮮玻碳電極表面，室溫干燥后，浸入新制納米金溶液（10－12 mol/L）即得PANI-NF/AuNPs納米復合膜；將復合膜修飾電極在谷胱甘肽（5.0 g/L）溶液中反應后得GCE/PANI-NF/AuNPs/GSH；將此傳感界面在15 mmol/L NHS/75 mmol/L EDC存在條件下與葉酸（50 mmol/L）反應得GCE/PANI-NF/AuNPs/GSH/FA；用5 g/L BSA封堵空余的活性位點（圖2）。每步處理后均用去離子水清洗，氮氣吹干。

2.3 HeLa細胞的培養

取HeLa細胞置于含有10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 mg/L的RPMI 1640培養液中，在37 ℃，5% CO2培養箱常規培養，隔天更換培養皿中的培養基。取對數生長期細胞進行實驗，使用前加入胰蛋白酶消化液，消化后用PBS（pH 7.4）溶液反復清洗3次，然后用PBS溶液配制成一定濃度。實驗前用細胞計數板確定細胞的濃度。

2.4 HeLa細胞的特異性識別以及電化學檢測

取10

SymbolmA@ L一定濃度的細胞懸浮液浸潤PANI-NF/AuNPs/GSH/FA-BSA傳感界面，37 ℃條件下孵育2 h，再將所得傳感界面浸入PBS（pH 7.4）溶液2 min，除去傳感界面上沒有特異性識別的細胞。采用循環伏安法和電化學阻抗技術研究傳感界面對HeLa細胞的捕獲和特異性識別情況。

2.5 AFM研究電極界面的修飾過程

以洗凈的玻片為基底，按照2.2節的方法模擬電極修飾過程。在空氣中用AFM研究電極修飾過程界面形貌的變化情況以及修飾界面對HeLa細胞的識別情況。選用UL20B硅探針（硅探針的曲率半徑小于10 nm），接觸模式下對樣品掃描成像。細胞用4%多聚甲醛處理20 min，再用PBS和去離子水清洗，4 ℃干燥待測。所得數據用IP2.1軟件處理。3 結果和討論

3.1 PANI-NF/AuNPs復合物膜的TEM表征

用TEM觀察制備的PANI-NF的形貌。由圖3a可見，PANI-NF呈均一的纖維狀結構，其直徑在50～70 nm范圍，分散性良好。由圖3b可見，合成的AuNPs呈球狀且大小均一，其直徑約為15 nm。PANI-NF浸泡在AuNPs溶液2 h后，AuNPs大量吸附在PANI-NF表面（圖3c和圖3d）。這是由于在酸性介質條件下，合成的PANI-NF帶有正電荷，用檸檬酸還原法合成的AuNPs帶有負電荷，AuNPs通過靜電作用吸附在PANI-NF表面。AuNPs的吸附一方面有利于增加傳感界面的表面積，促進電子在溶液和電極間的傳遞；另一方面，AuNPs的引入有利于進一步在界面上修飾特定生物分子。

圖3 PANI-NF（a），AuNPs（b）和PANI-NF/AuNPs（c， d）的TEM圖

Fig．3 TEM characterization of PANI-NF（a）， AuNPs（b） and PANI-NF/AuNPs（c， d）

3.2 PANI-NF/AuNPs復合物膜界面的電化學性質

以3－/4－為探針，對納米復合膜的電化學性質進行研究。如圖4所示，PANI-NF和AuNPs引入到電極界面后，峰電流增加，峰電位差減少，這說明納米材料對氧化還原探針有明顯的電催化作用。 

比較了納米材料修飾前后電位掃描速度對峰電流的影響。在納米復合膜界面上，氧化還原探針的峰電流與掃描速率的平方根成正比，說明此時電極表面反應動力學過程是受參與反應離子的擴散控制。對于可逆過程，由Randles-Sevcik公式 計算得電極有效面積A：

ipc＝（2.69×105）n3/2AD1/2υ1/2C0（1）

由n＝1，D＝6.5×106 cm2/s，計算GCE、GCE/PANI-NF和GCE/PANI-NF/AuNPs的電極有效面積分別為0.15， 0.24和0.27 cm2; 修飾電極的表面積約是GCE的2倍，說明納米材料增大了電極界面的有效面積。

3.3 PANI-NF/AuNPs復合膜界面葉酸功能化過程的電化學表征

采用循環伏安法（CV）對復合膜界面葉酸功能化過程進行表征（圖5）。在PANI-NF/AuNPs復合膜界面， GSH與納米金通過AuS鍵結合，由于GSH為非電活性物質，降低了界面的導電能力，峰電流明顯下降；其次，在生物偶聯劑EDC和NHS作用下，GSH的NH2與葉酸的COOH形成酰胺鍵，界面的導電能力和峰電流進一步下降；為減少細胞在界面上的非特異性吸附，用BSA封堵傳感界面上未修飾的空余位點，BSA同樣為非電活性物質，峰電流繼續下降。將葉酸功能化傳感界面用于特異性識別HeLa細胞，可觀察到峰電流明顯下降，表明HeLa細胞被成功捕獲到傳感器復合膜界面。

采用電化學阻抗技術考察復合膜界面葉酸功能化過程阻抗的變化情況。如圖6所示，當電極形成PANI-NF/AuNPs復合膜后，氧化還原探針Fe（CN）63－/4－ 在溶液/電極界面上的電荷轉移電阻Rct明顯減少，這同樣是由于納米材料的引入引起界面性質的變化。當GSH和FA偶聯到界面后，界面Rct顯著增大，電化學阻抗值增大；BSA封堵未修飾傳感界面上空余位點后，阻抗值進一步增大。將葉酸功能化復合膜界面用于特異性識別HeLa細胞，阻抗值增大，表明細胞被成功捕獲到傳感界面，EIS結果與循環伏安法所得結果一致。

以上實驗結果表明，電化學阻抗技術和循環伏安法均能監測到傳感器對HeLa細胞的特異性識別。比較兩種方法，對HeLa細胞特異性識別后，循環伏安氧化還原峰形變差，峰電流值靈敏度下降；而電化學阻抗變化值明顯。同時電化學阻抗測量過程中沒有電流通過界面，對界面的生物分子和細胞無損傷作用。因此，本實驗采用電化學阻抗技術對細胞的特異性識別和檢測進行研究。

3.4 細胞傳感器復合膜界面AFM的表征

傳感界面的層層修飾和分子組裝可通過AFM探測進行可視化表征。在PANI-NF-NF/AuNPs復合膜界面修飾上GSH與FA后，界面粗糙度略有降低；平均高度明顯增大（圖7a～7c）。將葉酸功能化復合膜界面用于特異性識別HeLa細胞，AFM觀察結果表明，細胞被成功捕獲到傳感界面（圖7d）。

3.5 葉酸功能化界面構建過程的實驗條件優化及其對HeLa細胞的識別

3.5.1 PANI-NF膜厚度的優化 PANI-NF膜的厚度決定AuNPs的吸附量，進而影響FA的修飾量。本實驗改變PANI-NF滴涂濃度，從而改變PANI-NF膜的厚度。實驗表明，低濃度PANI-NF能夠促進電子在溶液的電極間的傳遞，高濃度阻礙電子的傳遞。為了能吸附更多的AuNPs，同時得到最優的阻抗信號；綜合考慮，取10

SymbolmA@ L 0.2 g/L PANI-NF滴涂在電極表面。室溫干燥后再浸入新制AuNPs溶液（10－12mol/L）2 h，即得PANI-NF/AuNPs納米復合膜界面。

3.5.2 PANI-NF/AuNPs復合膜修飾GSH時間的優化 考察PANI-NF/AuNPs復合膜修飾GSH時間對阻抗信號的影響。結果表明，反應3 h后， 阻抗值變化趨于平穩。本研究中修飾GSH的時間選擇為3 h。

3.5.3 FA偶聯時間的優化 在生物偶聯劑EDC和NHS作用下，GSH的-NH2與葉酸的-COOH發生偶聯反應，當反應2 h后，阻抗值變化趨于平穩。本研究GSH與FA的偶聯反應時間選擇2 h。

3.5.4 HeLa細胞特異性識別的作用時間 PANI-NF/AuNPs復合膜界面修飾的FA與HeLa細胞表面大量表達的FR之間能夠特異性的結合，從而達到識別檢測癌細胞的目的。當HeLa細胞的濃度為5.0×104 cells/mL，隨著傳感界面與HeLa細胞孵育時間的增加，阻抗值增加，2 h后，阻抗值趨于穩定，說明傳感界面對HeLa細胞的識別捕獲達到飽和。本研究選擇2 h作為HeLa細胞特異性識別的時間。

3.6 葉酸功能化傳感界面對癌細胞識別的特異性

為了考察葉酸功能化傳感界面對癌細胞識別的特異性，比較了人淋巴細胞、血紅細胞和HeLa細胞在傳感界面識別后阻抗的變化情況。當傳感界面與人淋巴細胞、血紅細胞孵育后，界面阻抗未發生明顯的變化，說明界面未能捕獲到細胞；而傳感界面與HeLa細胞孵育后，阻抗明顯增加，表明所構建的葉酸功能化傳感界面對HeLa細胞具有良好的特異性識別及捕獲能力。

3.7 葉酸功能化傳感界面對HeLa細胞濃度的檢測

在優化實驗條件下，將所構建的傳感器對不同濃度HeLa細胞進行檢測。如圖8所示，隨著HeLa細胞濃度的增加，阻抗值線性增大。以葉酸功能化傳感界面的阻抗值為Rct（0），以測得對應濃度HeLa細胞識別后的阻抗值為Rct（c），以阻抗的變化值ΔRct（ΔRct＝Rct（c）－Rct（0））對細胞濃度的對數值logCcell作圖，細胞在1.0×104～6.4×106 cells/mL濃度范圍內與ΔRct呈良好的線性關系，線性方程為ΔRct＝－2.4174×105＋6.2895×103logCcell，R＝0.9905；檢出限可達2000 cells/mL（圖8內插圖）。

用倒置顯微鏡觀察修飾界面對不同濃度癌細胞的識別情況，隨著癌細胞濃度的增加，界面上捕獲的癌細胞的數目也隨之增多。同時，這也說明阻抗的增加是由于界面上識別了更多的癌細胞引起的。

本研究構建的傳感界面能特異性識別表面葉酸受體超量表達的細胞；且與文獻報道的電化學細胞傳感器相比，具有較高的靈敏度（表1）。

3.8 傳感器的重現性、穩定性和再生

利用構建的傳感器連續10次測定2000 cells/mLHeLa細胞識別后的電化學阻抗譜，ΔRct的相對標準偏差為1.9%，說明所構建的傳感器具有良好的重現性。將構建的傳感器放置4 ℃冰箱保存備用，4 星期后傳感器Rct未發生明顯變化，

說明所構建的傳感器具有良好的穩定性。用0.1 mol/L檸檬酸-氨基乙酸-鹽酸（pH 3.0）溶液洗脫傳感界面上已捕獲的細胞。實驗表明，細胞被洗脫后，與原修飾傳感界面相比，阻抗未發生明顯變化，說明所構建的傳感器經處理后可以再生利用，且效果良好。

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Construction of Electrochemical Cytosensor Based on

Polyaniline Nanofiber/Gold Nanoparticle Interface

and Its Application to Detection of Cancer Cell

WANG Hui1， WANG Tian2， YE Yan-Xia3， ZHANG Ya-Xing3，

YANG Pei-Hui*1，4， CAI Huai-Hong1， CAI Ji-Ye1，4



（1Department of Chemistry， 2School of Pharmacy， 3Institute of Tissue Transplantation and Immunology，

4Key Laboratory of Optoelectronic Information and Sensing Technologies of Guangdong Higher

Education Institutes， Ji′nan University， Guangzhou 510632）



Abstract Polyaniline nanofiber（PANI-NF） was synthesized with diameters about 60－80 nm. The polyaniline nanofiber/gold nanoparticle（PANI-NF/AuNPs） nanocomposite was then fabricated with a simple electrostatic reaction between the presence of positive charges on the surface of PANI-NF and the negatively charged of AuNPs. Therefore， a novel electrochemical cytosensor was designed by self-assemble folic acid on PANI-NF/AuNPs nanocomposite film interface. An electrochemical impedance method was used to detect folate receptor on cancer cells with the specific interaction between folate immobilized on PANI-NF/AuNPs surface and its receptor which was over-expressed on cancer cell membrane. Experimental results showed that PANI-NF/AuNPs cytosensor specifically recognized cancer cells， such as Hela cells， which were resulted from the change of conduct field of electrode after cancer cells attachment. A linearity from 1.0×104 to 6.4×106 cells/mL at a concentration down to 2000 cells/mL was obtained. This cytosensor has some advantages of easy construction， quick detection， high sensitivity， easy recurrence， well stability and free additional labeling， and can be introduced for highly sensitive cell-based sensing. 

Keywords Cytosensor; Polyaniline nanofibers; Gold nanoparticles; Cancer cell（Received 21 May 2011; accepted 7 July 2011）