基于聚苯胺納米纖維復(fù)合膜界面構(gòu)建電化學(xué)細(xì)胞傳感器及其對癌細(xì)胞的識別檢測

摘 要 合成了聚苯胺納米纖維，直徑在50～70 nm之間；基于靜電作用構(gòu)建聚苯胺納米纖維-納米金復(fù)合膜界面，并在此界面上層層組裝修飾葉酸分子，構(gòu)建葉酸功能化傳感界面，基于葉酸分子與癌細(xì)胞表面過量表達(dá)的葉酸受體之間的特異性識別作用，將此傳感界面應(yīng)用于對癌細(xì)胞的識別和捕獲。結(jié)果表明： 葉酸功能化傳感界面能夠特異性識別和捕獲葉酸受體過量表達(dá)的癌細(xì)胞。采用電化學(xué)阻抗技術(shù)，以HeLa細(xì)胞為模型，應(yīng)用于對癌細(xì)胞的識別和檢測，細(xì)胞在1.0×104～6.4×106 cells/mL濃度范圍內(nèi)與阻抗變化值ΔRct呈良好的線性關(guān)系；檢出限為2000 cells/mL。本方法簡單、快速靈敏、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好；制備的傳感器可以再生使用。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞傳感器; 聚苯胺納米纖維; 納米金; 癌細(xì)胞

1 引 言

基于電化學(xué)檢測的細(xì)胞傳感器，是通過測量電化學(xué)信號（如電流、阻抗及電容等）分析評價(jià)細(xì)胞，目前已成為生物傳感器研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。電化學(xué)技術(shù)可對細(xì)胞生長發(fā)育以及細(xì)胞功能變化等方面提供相關(guān)信息。近年來，一系列電化學(xué)細(xì)胞傳感器已用于對細(xì)胞的類別、濃度、活性、增殖、擴(kuò)散、調(diào)亡及細(xì)胞內(nèi)外分子的分布等的研究。電化學(xué)阻抗技術(shù)因其對細(xì)胞無創(chuàng)傷性及細(xì)胞在電極界面的高阻抗性而被用于研究細(xì)胞的生理學(xué)、形態(tài)學(xué)及細(xì)胞功能變化等。

目前，用于構(gòu)建電化學(xué)細(xì)胞傳感器界面的材料主要有殼聚糖、納米金、碳納米管等生物相容性好的材料。Chen等基于鍵合生物相容性的殼聚糖（CS）和具有良好導(dǎo)電性的碳納米管（CNF）形成復(fù)合膜，控制電沉積形成的CS-CNF納米復(fù)合物膜具有良好的生物相容性，可用于固定K562細(xì)胞。Zhang等基于功能化碳納米管（PDCNx）、硫堇（TH）和納米金（AuNPs），通過層層組裝方式形成三維結(jié)構(gòu)基底，制備了可用于評價(jià)細(xì)胞表面P-gp表達(dá)量的生物傳感器。Ding等在絲網(wǎng)印刷碳電極上電聚合聚苯胺，利用電聚合聚苯胺界面吸附細(xì)胞，通過測量細(xì)胞吸附后阻抗的變化研究和監(jiān)測K562細(xì)胞的粘附和增殖；實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞可以在聚苯胺界面生長增殖，說明聚苯胺具有良好的生物相容性。目前，利用聚苯胺納米纖維（PANI-NF）作為基底材料構(gòu)建電化學(xué)細(xì)胞傳感器界面尚未見報(bào)道。 圖1 葉酸的分子結(jié)構(gòu)

Fig．1 Structure of folic acid（FA）

葉酸（FA），即維生素B9，是親水性的小分子，其分子結(jié)構(gòu)式如圖1。葉酸受體（FR）被稱作高親和性葉酸結(jié)合蛋白，膜表面的FR可與FA特異性結(jié)合。FR在正常組織表達(dá)高度保守，而在大部分惡性腫瘤中高度表達(dá)， 有時(shí)比正常組織高100～300倍。

本研究將PANI-NF與AuNPs復(fù)合形成納米復(fù)合膜界面，在PANI-NF/AuNPs界面上層層組裝修飾上葉酸（FA），構(gòu)建了新的傳感界面電化學(xué)細(xì)胞傳感器（圖2）。以PANI-NF為基底，具有高的比表面積和帶正電荷，對AuNPs有較好的吸附能力，有利于界面修飾生物分子；同時(shí)用BSA封堵傳感界面上空余的活性位點(diǎn)，提高傳感界面的特異性識別能力，可應(yīng)用于癌細(xì)胞的識別與檢測，進(jìn)一步應(yīng)用于其它細(xì)胞功能性研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

CHI660a電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；TECNAI-10透射電鏡（TEM，美國Philips公司）； Autoprobe CP Research原子力顯微鏡（AFM，美國Thermo Microscopes公司）。

苯胺、過硫酸銨（廣州化學(xué)試劑廠），葉酸、谷胱甘肽、NHS、EDC（AR，Aldrich公司），其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4，含有8 mmol/L Na2HPO4， 1.5 mmol/L KH2PO4，137 mmol/L NaCl和27 mmol/L KCl）。

HeLa細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫）。人淋巴細(xì)胞和血紅細(xì)胞由健康人外周血中分離獲得。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)液為RPMI1640（Sigma公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。RPMI1640培養(yǎng)基在使用前加入新生牛血清和雙抗儲備液（青霉素十鏈霉素），使血清的含量為10%，青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 mg/L。

2.2 復(fù)合膜修飾電極的制備

制備聚苯胺納米纖維和納米金參考文獻(xiàn)。取10

SymbolmA@ L 0.2 g/L PANI-NF溶液滴涂在新鮮玻碳電極表面，室溫干燥后，浸入新制納米金溶液（10－12 mol/L）即得PANI-NF/AuNPs納米復(fù)合膜；將復(fù)合膜修飾電極在谷胱甘肽（5.0 g/L）溶液中反應(yīng)后得GCE/PANI-NF/AuNPs/GSH；將此傳感界面在15 mmol/L NHS/75 mmol/L EDC存在條件下與葉酸（50 mmol/L）反應(yīng)得GCE/PANI-NF/AuNPs/GSH/FA；用5 g/L BSA封堵空余的活性位點(diǎn)（圖2）。每步處理后均用去離子水清洗，氮?dú)獯蹈伞＊?/p>

2.3 HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)

取HeLa細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 mg/L的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用前加入胰蛋白酶消化液，消化后用PBS（pH 7.4）溶液反復(fù)清洗3次，然后用PBS溶液配制成一定濃度。實(shí)驗(yàn)前用細(xì)胞計(jì)數(shù)板確定細(xì)胞的濃度。

2.4 HeLa細(xì)胞的特異性識別以及電化學(xué)檢測

取10

SymbolmA@ L一定濃度的細(xì)胞懸浮液浸潤PANI-NF/AuNPs/GSH/FA-BSA傳感界面，37 ℃條件下孵育2 h，再將所得傳感界面浸入PBS（pH 7.4）溶液2 min，除去傳感界面上沒有特異性識別的細(xì)胞。采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗技術(shù)研究傳感界面對HeLa細(xì)胞的捕獲和特異性識別情況。

2.5 AFM研究電極界面的修飾過程

以洗凈的玻片為基底，按照2.2節(jié)的方法模擬電極修飾過程。在空氣中用AFM研究電極修飾過程界面形貌的變化情況以及修飾界面對HeLa細(xì)胞的識別情況。選用UL20B硅探針（硅探針的曲率半徑小于10 nm），接觸模式下對樣品掃描成像。細(xì)胞用4%多聚甲醛處理20 min，再用PBS和去離子水清洗，4 ℃干燥待測。所得數(shù)據(jù)用IP2.1軟件處理。3 結(jié)果和討論

3.1 PANI-NF/AuNPs復(fù)合物膜的TEM表征

用TEM觀察制備的PANI-NF的形貌。由圖3a可見，PANI-NF呈均一的纖維狀結(jié)構(gòu)，其直徑在50～70 nm范圍，分散性良好。由圖3b可見，合成的AuNPs呈球狀且大小均一，其直徑約為15 nm。PANI-NF浸泡在AuNPs溶液2 h后，AuNPs大量吸附在PANI-NF表面（圖3c和圖3d）。這是由于在酸性介質(zhì)條件下，合成的PANI-NF帶有正電荷，用檸檬酸還原法合成的AuNPs帶有負(fù)電荷，AuNPs通過靜電作用吸附在PANI-NF表面。AuNPs的吸附一方面有利于增加傳感界面的表面積，促進(jìn)電子在溶液和電極間的傳遞；另一方面，AuNPs的引入有利于進(jìn)一步在界面上修飾特定生物分子。

圖3 PANI-NF（a），AuNPs（b）和PANI-NF/AuNPs（c， d）的TEM圖

Fig．3 TEM characterization of PANI-NF（a）， AuNPs（b） and PANI-NF/AuNPs（c， d）

3.2 PANI-NF/AuNPs復(fù)合物膜界面的電化學(xué)性質(zhì)

以3－/4－為探針，對納米復(fù)合膜的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。如圖4所示，PANI-NF和AuNPs引入到電極界面后，峰電流增加，峰電位差減少，這說明納米材料對氧化還原探針有明顯的電催化作用。 

比較了納米材料修飾前后電位掃描速度對峰電流的影響。在納米復(fù)合膜界面上，氧化還原探針的峰電流與掃描速率的平方根成正比，說明此時(shí)電極表面反應(yīng)動力學(xué)過程是受參與反應(yīng)離子的擴(kuò)散控制。對于可逆過程，由Randles-Sevcik公式 計(jì)算得電極有效面積A：

ipc＝（2.69×105）n3/2AD1/2υ1/2C0（1）

由n＝1，D＝6.5×106 cm2/s，計(jì)算GCE、GCE/PANI-NF和GCE/PANI-NF/AuNPs的電極有效面積分別為0.15， 0.24和0.27 cm2; 修飾電極的表面積約是GCE的2倍，說明納米材料增大了電極界面的有效面積。

3.3 PANI-NF/AuNPs復(fù)合膜界面葉酸功能化過程的電化學(xué)表征

采用循環(huán)伏安法（CV）對復(fù)合膜界面葉酸功能化過程進(jìn)行表征（圖5）。在PANI-NF/AuNPs復(fù)合膜界面， GSH與納米金通過AuS鍵結(jié)合，由于GSH為非電活性物質(zhì)，降低了界面的導(dǎo)電能力，峰電流明顯下降；其次，在生物偶聯(lián)劑EDC和NHS作用下，GSH的NH2與葉酸的COOH形成酰胺鍵，界面的導(dǎo)電能力和峰電流進(jìn)一步下降；為減少細(xì)胞在界面上的非特異性吸附，用BSA封堵傳感界面上未修飾的空余位點(diǎn)，BSA同樣為非電活性物質(zhì)，峰電流繼續(xù)下降。將葉酸功能化傳感界面用于特異性識別HeLa細(xì)胞，可觀察到峰電流明顯下降，表明HeLa細(xì)胞被成功捕獲到傳感器復(fù)合膜界面。

采用電化學(xué)阻抗技術(shù)考察復(fù)合膜界面葉酸功能化過程阻抗的變化情況。如圖6所示，當(dāng)電極形成PANI-NF/AuNPs復(fù)合膜后，氧化還原探針Fe（CN）63－/4－ 在溶液/電極界面上的電荷轉(zhuǎn)移電阻Rct明顯減少，這同樣是由于納米材料的引入引起界面性質(zhì)的變化。當(dāng)GSH和FA偶聯(lián)到界面后，界面Rct顯著增大，電化學(xué)阻抗值增大；BSA封堵未修飾傳感界面上空余位點(diǎn)后，阻抗值進(jìn)一步增大。將葉酸功能化復(fù)合膜界面用于特異性識別HeLa細(xì)胞，阻抗值增大，表明細(xì)胞被成功捕獲到傳感界面，EIS結(jié)果與循環(huán)伏安法所得結(jié)果一致。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電化學(xué)阻抗技術(shù)和循環(huán)伏安法均能監(jiān)測到傳感器對HeLa細(xì)胞的特異性識別。比較兩種方法，對HeLa細(xì)胞特異性識別后，循環(huán)伏安氧化還原峰形變差，峰電流值靈敏度下降；而電化學(xué)阻抗變化值明顯。同時(shí)電化學(xué)阻抗測量過程中沒有電流通過界面，對界面的生物分子和細(xì)胞無損傷作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用電化學(xué)阻抗技術(shù)對細(xì)胞的特異性識別和檢測進(jìn)行研究。

3.4 細(xì)胞傳感器復(fù)合膜界面AFM的表征

傳感界面的層層修飾和分子組裝可通過AFM探測進(jìn)行可視化表征。在PANI-NF-NF/AuNPs復(fù)合膜界面修飾上GSH與FA后，界面粗糙度略有降低；平均高度明顯增大（圖7a～7c）。將葉酸功能化復(fù)合膜界面用于特異性識別HeLa細(xì)胞，AFM觀察結(jié)果表明，細(xì)胞被成功捕獲到傳感界面（圖7d）。

3.5 葉酸功能化界面構(gòu)建過程的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化及其對HeLa細(xì)胞的識別

3.5.1 PANI-NF膜厚度的優(yōu)化 PANI-NF膜的厚度決定AuNPs的吸附量，進(jìn)而影響FA的修飾量。本實(shí)驗(yàn)改變PANI-NF滴涂濃度，從而改變PANI-NF膜的厚度。實(shí)驗(yàn)表明，低濃度PANI-NF能夠促進(jìn)電子在溶液的電極間的傳遞，高濃度阻礙電子的傳遞。為了能吸附更多的AuNPs，同時(shí)得到最優(yōu)的阻抗信號；綜合考慮，取10

SymbolmA@ L 0.2 g/L PANI-NF滴涂在電極表面。室溫干燥后再浸入新制AuNPs溶液（10－12mol/L）2 h，即得PANI-NF/AuNPs納米復(fù)合膜界面。

3.5.2 PANI-NF/AuNPs復(fù)合膜修飾GSH時(shí)間的優(yōu)化 考察PANI-NF/AuNPs復(fù)合膜修飾GSH時(shí)間對阻抗信號的影響。結(jié)果表明，反應(yīng)3 h后， 阻抗值變化趨于平穩(wěn)。本研究中修飾GSH的時(shí)間選擇為3 h。

3.5.3 FA偶聯(lián)時(shí)間的優(yōu)化 在生物偶聯(lián)劑EDC和NHS作用下，GSH的-NH2與葉酸的-COOH發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)2 h后，阻抗值變化趨于平穩(wěn)。本研究GSH與FA的偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間選擇2 h。

3.5.4 HeLa細(xì)胞特異性識別的作用時(shí)間 PANI-NF/AuNPs復(fù)合膜界面修飾的FA與HeLa細(xì)胞表面大量表達(dá)的FR之間能夠特異性的結(jié)合，從而達(dá)到識別檢測癌細(xì)胞的目的。當(dāng)HeLa細(xì)胞的濃度為5.0×104 cells/mL，隨著傳感界面與HeLa細(xì)胞孵育時(shí)間的增加，阻抗值增加，2 h后，阻抗值趨于穩(wěn)定，說明傳感界面對HeLa細(xì)胞的識別捕獲達(dá)到飽和。本研究選擇2 h作為HeLa細(xì)胞特異性識別的時(shí)間。

3.6 葉酸功能化傳感界面對癌細(xì)胞識別的特異性

為了考察葉酸功能化傳感界面對癌細(xì)胞識別的特異性，比較了人淋巴細(xì)胞、血紅細(xì)胞和HeLa細(xì)胞在傳感界面識別后阻抗的變化情況。當(dāng)傳感界面與人淋巴細(xì)胞、血紅細(xì)胞孵育后，界面阻抗未發(fā)生明顯的變化，說明界面未能捕獲到細(xì)胞；而傳感界面與HeLa細(xì)胞孵育后，阻抗明顯增加，表明所構(gòu)建的葉酸功能化傳感界面對HeLa細(xì)胞具有良好的特異性識別及捕獲能力。

3.7 葉酸功能化傳感界面對HeLa細(xì)胞濃度的檢測

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將所構(gòu)建的傳感器對不同濃度HeLa細(xì)胞進(jìn)行檢測。如圖8所示，隨著HeLa細(xì)胞濃度的增加，阻抗值線性增大。以葉酸功能化傳感界面的阻抗值為Rct（0），以測得對應(yīng)濃度HeLa細(xì)胞識別后的阻抗值為Rct（c），以阻抗的變化值ΔRct（ΔRct＝Rct（c）－Rct（0））對細(xì)胞濃度的對數(shù)值logCcell作圖，細(xì)胞在1.0×104～6.4×106 cells/mL濃度范圍內(nèi)與ΔRct呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔRct＝－2.4174×105＋6.2895×103logCcell，R＝0.9905；檢出限可達(dá)2000 cells/mL（圖8內(nèi)插圖）。

用倒置顯微鏡觀察修飾界面對不同濃度癌細(xì)胞的識別情況，隨著癌細(xì)胞濃度的增加，界面上捕獲的癌細(xì)胞的數(shù)目也隨之增多。同時(shí)，這也說明阻抗的增加是由于界面上識別了更多的癌細(xì)胞引起的。

本研究構(gòu)建的傳感界面能特異性識別表面葉酸受體超量表達(dá)的細(xì)胞；且與文獻(xiàn)報(bào)道的電化學(xué)細(xì)胞傳感器相比，具有較高的靈敏度（表1）。

3.8 傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和再生

利用構(gòu)建的傳感器連續(xù)10次測定2000 cells/mLHeLa細(xì)胞識別后的電化學(xué)阻抗譜，ΔRct的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%，說明所構(gòu)建的傳感器具有良好的重現(xiàn)性。將構(gòu)建的傳感器放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫? 星期后傳感器Rct未發(fā)生明顯變化，

說明所構(gòu)建的傳感器具有良好的穩(wěn)定性。用0.1 mol/L檸檬酸-氨基乙酸-鹽酸（pH 3.0）溶液洗脫傳感界面上已捕獲的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞被洗脫后，與原修飾傳感界面相比，阻抗未發(fā)生明顯變化，說明所構(gòu)建的傳感器經(jīng)處理后可以再生利用，且效果良好。

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Construction of Electrochemical Cytosensor Based on

Polyaniline Nanofiber/Gold Nanoparticle Interface

and Its Application to Detection of Cancer Cell

WANG Hui1， WANG Tian2， YE Yan-Xia3， ZHANG Ya-Xing3，

YANG Pei-Hui*1，4， CAI Huai-Hong1， CAI Ji-Ye1，4



（1Department of Chemistry， 2School of Pharmacy， 3Institute of Tissue Transplantation and Immunology，

4Key Laboratory of Optoelectronic Information and Sensing Technologies of Guangdong Higher

Education Institutes， Ji′nan University， Guangzhou 510632）



Abstract Polyaniline nanofiber（PANI-NF） was synthesized with diameters about 60－80 nm. The polyaniline nanofiber/gold nanoparticle（PANI-NF/AuNPs） nanocomposite was then fabricated with a simple electrostatic reaction between the presence of positive charges on the surface of PANI-NF and the negatively charged of AuNPs. Therefore， a novel electrochemical cytosensor was designed by self-assemble folic acid on PANI-NF/AuNPs nanocomposite film interface. An electrochemical impedance method was used to detect folate receptor on cancer cells with the specific interaction between folate immobilized on PANI-NF/AuNPs surface and its receptor which was over-expressed on cancer cell membrane. Experimental results showed that PANI-NF/AuNPs cytosensor specifically recognized cancer cells， such as Hela cells， which were resulted from the change of conduct field of electrode after cancer cells attachment. A linearity from 1.0×104 to 6.4×106 cells/mL at a concentration down to 2000 cells/mL was obtained. This cytosensor has some advantages of easy construction， quick detection， high sensitivity， easy recurrence， well stability and free additional labeling， and can be introduced for highly sensitive cell-based sensing. 

Keywords Cytosensor; Polyaniline nanofibers; Gold nanoparticles; Cancer cell（Received 21 May 2011; accepted 7 July 2011）