分子印跡膠體陣列檢測對硝基苯酚

摘 要 以對硝基苯酚（p-NP）為印跡模板，丙烯酰胺為功能單體， 制備單分散的對硝基苯酚分子印跡膠體微球。通過垂直沉降法將分子印跡膠體微球自組裝為分子印跡膠體陣列，采用膠帶將分子印跡膠體陣列粘貼固定。固定于膠帶上的分子印跡膠體陣列膜顯示出良好的穩定性，而且對目標分子p-NP具有明顯的光學響應。分子印跡微球吸附目標分子發生溶脹，引起膠體陣列溶漲，分子印跡膠體陣列（MICA）反射峰位置發生移動。實驗結果顯示，MICA隨著p-NP濃度增加，反射峰紅移近60 nm，MICA表面顏色由紅色逐漸變為藍紫色; 而非印跡膠體陣列紅移量只約40 nm。MICA簡化了光子晶體凝膠傳感材料的制備步驟，為開發新型高性能生化傳感器材料提供了新思路。

關鍵詞 光子晶體； 膠體陣列； 分子印跡； 對硝基苯酚

1 引 言

對硝基苯酚（p-Nitrophenol，p-NP）是一種常見的環境內分泌干擾物，能夠刺激并抑制中樞神經，嚴重時將出現高鐵血色素癥和呼吸困難，因此對其監測和評價有重要的應用價值。傳統p-NP檢測方法主要基于高效液相色譜等分析手段，儀器貴重，操作復雜耗時。因此，實現簡便操作，微型化，直觀裸眼檢測等性能成為新型分析傳感材料的主要研究方向。

光子晶體（Photonic crystal，PC）具有完美的光學調控性能，根據布拉格衍射定律，其結構的微變能夠引起衍射波長的顯著變化。這為實現“裸眼檢測”提供了可能，所以近年來光子晶體在分析化學，尤其是化學傳感器領域的應用受到了科研工作者的高度重視。目前文獻中所報道的光子晶體傳感材料大致可分為兩類：一類用膠體晶體模板反向復制法制備具有三維有序大孔結構的光子晶體凝膠材料; 另一類在膠體晶體的間隙填充功能化凝膠。兩種方法均需要有高分子凝膠聚合的步驟，而這一步驟通常會破壞膠體晶體的規則排列結構，而且也增加了制備的步驟和周期；另外，功能化凝膠通常對帶有特定官能團的一類物質都有響應，其選擇性并不高。分子印跡技術是當前發展高選擇性材料的主要方法之一，分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymers， MIPs）對模板分子具有高度的選擇識別性能。研究表明， 將分子印跡技術與光子晶體相結合，可以提高光子晶體傳感材料的選擇性。

鑒于常規光子晶體傳感材料突顯的缺點，本研究用單分散的分子印跡膠體微球自組裝成分子印跡膠體陣列（Molecularly imprinted colloidal array， MICA），然后通過用膠帶將印跡膠體陣列粘下，達到固定的效果。MICA本身就具有光子晶體結構，而且膠體陣列是由帶印跡的膠體微球組成，本身就能夠識別模板分子，所以不需要在陣列間隙再填充其它凝膠。印跡微球特異性吸附模板分子引起微球溶脹，使密堆積的MICA發生溶漲，進而使MICA的衍射光學信號發生變化，達到了傳感的目的。

MICA既將分子印跡技術與光子晶體技術相結合，提升光子晶體傳感材料的選擇性，同時避免了材料微觀規則結構的破壞，更重要的是簡化了制備光子晶體傳感材料的步驟。

2 實驗方法

2.1 儀器與試劑

IKA RW20數字攪拌器、IKA C-MAG HS7控溫儀（IKA公司）；HWS-ISO恒溫恒濕箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠）；S-4800掃描電鏡（HITACHI）；Avaspec-2048TEC微型光纖光譜儀（Avantes），其中光源型號是AvaLight-DH-S-BAL， 光纖型號是FC-UV600-2-SR； LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器（島津公司）。色譜條件：C8反相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m，Agela公司）； 流動相為甲醇-水（55∶45，V/V），流速：1 mL/min；柱溫為室溫，檢測波長260 nm。鉆石牌蓋玻片（24 mm×50 mm），膠帶（寬12 mm，得力集團）。

對硝基苯酚，間硝基苯酚，苯酚，3-氨基苯酚（分析純，國藥集團）；丙烯酰胺（AM，分析純，天津市科密歐化試劑開發中心）；甲基丙基酸甲酯（MMA，分析純，天津博迪化工），過硫酸鉀（KPS，分析純，汕頭市西隴化工廠）；甲醇（色譜純，山東禹王實業有限公司）；乙酸，濃H2SO4，30% H2O2 （分析純， 北京化工廠）；超純水由AWL-0502-U艾科浦超純水系統制備（艾科浦公司）。 

2.2 p-NP分子印跡膠體微球的制備

將模板0.6956 g （5 mmol） p-NP和單體1.0662 g （15 mmol） AM超聲溶于30 mL MMA中，并與255 mL去離子水在燒瓶中混合，氮氣保護下攪拌加熱至80 ℃，再加入15 mL 0.04 g/mL 引發劑KPS溶液，恒溫攪拌45 min后，反應液依次用甲醇-乙酸（8∶2，V/V）溶液，甲醇，去離子水反復離心、去除上層清液， 重新超聲分散洗劑3次，以除去模板分子p-NP。制備非印跡膠體微球時，除不加模板分子，其它方法同上。

2.3 p-NP分子印跡膠體微球的印跡效果評價

將合成的分子印跡膠體微球和非印跡膠體微球置于60 ℃的真空干燥箱干燥。分別稱取2.5 mg印跡微球，并加入1 mL 0.5 g/L p-NP溶液，分別吸附5，10，20和40 min后，離心，取上清液供HPLC檢測。

分別稱取10 mg印跡微球，并分別加入1 mL濃度分別為1，5，10，25和50 g/L的p-NP甲醇-水（4∶6，V/V）溶液，振蕩吸附1 h， 離心， 取上清液供HPLC檢測。

2.4 p-NP分子印跡膠體陣列的制備及其傳感性能評價

以蓋玻片為基片，將蓋玻片浸泡到濃H2SO4-H2O2（7∶3，V/V）溶液中12 h后，用去離子水清洗干凈后吹干。將基片垂直貼于玻璃槽內，加入質量濃度為0.3%分子印跡膠體微球溶液，于恒溫恒濕（30 ℃、濕度50%）培養箱中控制溶液勻速揮發，小球通過表面張力自組裝于基片上形成MICA，用膠帶將MICA從蓋玻片上粘下。將MICA膜分別浸于濃度為0、10、20和30 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.0）中，用微型光纖光譜儀檢測MICA膜的反射光譜。

2.5 MICA對實際水樣的傳感響應

分別以實驗室自來水、百里峽景區泉水和玲瓏公園湖水為實際水樣，未檢出p-NP。將上述實際水樣進行抽濾，以除去其中的懸浮顆粒，再加入適量p-NP，分別配制成濃度為20 mmol/L p-NP溶液。將MICA膜浸于上述實際水樣中，用微型光纖光譜儀檢測MICA膜的反射光譜。

3 結果與討論

3.1 p-NP分子印跡膠體微球的制備

丙烯酰胺（AM）作為功能單體常用于識別硝基苯酚類化合物，在聚合之前，將模板p-NP和功能單體AM溶解在MMA中，超聲使模板與單體之間的氫鍵充分形成。模板p-NP與功能單體AM之間形成的氫鍵復合體隨著MMA聚合被包埋于微球之中。本研究所制備的分子印跡膠體微球單分散性好，球形度好，粒徑均一約為280 nm（圖1）。

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3.2 p-NP分子印跡膠體微球的印跡效果評價

3.2.1 吸附動力學 實驗表明，p-NP分子印跡膠體微球的吸附速度高于非印跡膠體微球，在10 min基本達到飽和。非印跡膠體微球也具有一定的吸附能力，可能的原因是非印跡膠體微球表面的功能單體AM與p-NP的非特異性氫鍵作用所致;但是，與印跡膠體微球相比，非印跡膠體微球上并沒有立體的特異性識別位點，所以吸附能力較弱（圖2）。

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3.2.2 平衡吸附實驗 圖3為分子印跡膠體微球及非印跡膠體微球對不同濃度的p-NP溶液的吸附等溫線。分子印跡膠體微球的吸附量隨p-NP濃度的增加而增大；且分子印跡膠體微球對p-NP的吸附量明顯高于非印跡膠體微球。這是因為分子印跡膠體微球在預聚合階段模板分子與功能單體由于氫鍵作用，形成配合物。配合物對模板分子具有印跡效果，交聯聚合后，形成穩定堅固的三維孔穴。在本研究的濃度范圍內，非印跡微球對p-NP也有吸附，但隨濃度變化不大；這可能是非印跡膠體微球的非特異性氫鍵作用所致，故在模板分子濃度較小時，非印跡膠體微球就已經達到吸附飽和。根據評價分子印跡聚合物結合特性的Scatchard模型，擬合得到分子印跡膠體微球結合位點的解離常數KD＝90.1 mmol/L，最大表觀結合量為Qmax＝1.8 mmol/g。

3.3 p-NP分子印跡膠體陣列的制備及其傳感性能評價

3.3.1 p-NP分子印跡膠體陣列的制備 通過垂直沉降法將單分散的分子印跡膠體微球自組裝為密堆積的膠體陣列。膠體陣列具有光子晶體結構，能夠產生布拉格衍射，反射特定波長的光，如果反射光處于可見光波區，膠體陣列即可顯示由于光子晶體結構引起的結構色。本研究所制備的分子印跡膠體微球尺寸約280 nm，反射光位置處于720 nm左右，結構色為紅色。通過垂直沉降法自組裝得到分子印跡膠體陣列，電鏡圖顯示印跡微球呈整齊的密堆積結構（圖4）。

處于基片上的MICA并不穩定，觸碰或浸入液體中均會破壞膠體陣列的結構。采用普通的透明膠帶將MICA從基片上粘下，得到陣列固定好的MICA膜。將MICA膜浸于水中，MICA膜仍能顯示出明顯的結構色，在光纖光譜儀下仍能顯示出良好的反射峰，說明膠條起到了很好的固定陣列的作用，同時處于膠體上的膠體陣列便于裁剪、檢測等操作。

3.3.2 p-NP分子印跡膠體陣列傳感性能評價

MICA是由單分散的p-NP分子印跡微球自組裝而成的具有光子晶體結構的膠體微球陣列，遵循布拉格衍射定律，能夠反射特定波長的光。對于密堆積的膠體陣列，有改進的布拉格衍射公式：

λmax＝1.633d（n2－sin2θ）1/2（1）

式中，λmax為反射峰波長，d是膠體微球的直徑，n是光子晶體的平均折光指數，θ是入射光與晶面的夾角。衍射條件表明，θ一定時，λmax正比于d，即膠體微球體積的改變可通過改變反射峰位置表現。由衍射方程可以推斷，如果分子識別過程能夠引起分子印跡膠體微球的溶脹或收縮，光學信號就可以被觀察到。如果反射峰處于可見光波區，膠體陣列結構的變化則可通過顏色的變化體現。 

將固定于膠帶上的MICA浸于一系列不同濃度的p-NP磷酸緩沖溶液中，用光纖光譜儀檢測其反射光譜。實驗表明，隨著p-NP濃度增加，MICA反射峰不斷紅移，到達30 mmol/L后，紅移量約達60 nm。為了驗證MICA的選擇性，同時測試了非印跡膠體陣列（Non-imprinted colloidal array， NICA）膜對p-NP溶液的光譜響應。由于NICA的微球在聚合時，沒有p-NP充當模板，所以微球表面和內部的有效識別位點沒有MICA多，對p-NP的吸附性能也就相應差一些。隨著p-NP濃度增加，NICA也發生紅移，但是紅移量明顯低于MICA。當濃度為30 mmol/L時，NICA反射光紅移量為42 nm。由于p-NP的磷酸鹽緩沖溶液呈黃色，掩蓋了MICA膜的結構色變化，將吸附平衡的MICA膜從不同濃度的p-NP溶液中取出，吹干，便可以明顯看到MICA表面結構色由紅色變為藍紫色（圖5）。

圖5 MICA （a），NICA （b） 膜對不同濃度p-NP磷酸緩沖溶液的光學傳感性能；（c）：MICA，NICA膜在不同濃度p-NP溶液中反射峰紅移量比較；（d）：MICA膜吸附不同濃度p-NP溶液后的顏色變化

Fig．5 Optical response of non-imprinted coloidal array （MICA） （a） and NICA （b） films in buffers with various concentrations of p-NP. （c） Plots of reflection shifts of MICA and NICA films vs. p-NP concentrations. （d） Color change induced by the adsorption of p-NP at different concentrations

選取與p-NP結構類似的間硝基苯酚（m-NP），對氨基苯酚，苯酚等作為參考物，進行光學傳感性能的測試，以驗證MICA膜的選擇性。如圖6所示，MICA膜對對氨基苯酚和苯酚溶液的濃度響應較弱，但是對m-NP的光學響應與p-NP相差不多。這是因為m-NP與p-NP的分子結構非常類似，特異性識別p-NP分子的印跡膠體微球表面的印跡結合位點同樣適應于m-NP分子。

圖6 MICA膜對結構類似物m-NP （a），3-氨基苯酚 （b），苯酚 （c） 溶液的光學傳感性能與對p-NP光學傳感性能的比較； （d） MICA膜吸附不同濃度結構類似物溶液后的反射峰紅移量比較

Fig．6 Optical response of MICA films in buffers with various concentrations of m-nitrophenol （a）， 3-amoniphenol （b）， phenol （c）. （d） Plots of reflection shifts of MICA films vs. p-NP and its analogues concentrations

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3.4 MICA對實際水樣的傳感響應

用實驗室自來水、百里峽泉水和玲瓏公園湖水為實際水樣，檢驗MICA對以實際水樣為溶液配制的p-NP溶液的光學性質。結果表明，MICA對實際水樣響應明顯，在實驗室自來水、百里峽泉水和玲瓏公園湖水樣品中，MICA分別紅移了45.0， 40.5和45.0 nm。實際樣品溶液的酸堿性和離子強度等性質有較大差異，但MICA對p-NP的響應仍較明顯，說明MICA對檢測環境的適應性較強。

4 結 論

MICA具有光子晶體結構，同具有貫通孔結構的光子晶體響應性凝膠類似，MICA對外界刺激具有光學響應，而且分子印跡膠體微球賦予了膠體陣列較好的選擇性。采用膠帶固定膠體陣列的方法簡單有效，節省了膠體陣列膜的制備周期，固定于膠帶上的MICA便于存儲和操作，為傳感材料的小型化和便攜化提供了可能。MICA對p-NP的響應可以通過表面結構色變化的方式呈現，這為裸眼檢測、直觀檢測提供了新方法。MICA是光子晶體傳感材料的優化和改進，為傳感材料制備方法簡便化及裸眼檢測提供了新途徑。

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Detection of p-Nitrophenol Using

Molecularly Imprinted Colloidal Array

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XUE Fei， WANG Yi-Fei， WANG Qiu-Hong， MENG Zi-Hui*， XUE Min， HUANG Shu-Yue， LU Wei

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（School of Chemical Engineering and Environment， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081）

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Abstract p-Nitrophenol molecularly imprinted colloidal microspheres were prepared by polymerization of functional monomers （acrylamide， AM） and template （p-nitrophenol， p-NP） in poly（methyl methacrylate， PMMA） pre-polymerization solution. Molecular imprinted colloidal array （MICA） was prepared using the molecularly imprinted colloidal microspheres by self-assembly and then fixed by an adhesive tape. The MICA on the adhesive tape is easy to handle and has strong stability. This material senses p-nitrophenol in aqueous solution by shifting reflection wavelength. The adsorption of p-nitrophenol into molecularly imprinted colloidal microspheres would swell the microspheres， thus leading to a reflection peak red shift. The reflection peak red shifted nearly 60 nm when the concentration of p-NP increases from 0 mmol/L to 30 mmol/L， while non-imprinted molecularly imprinted colloidal array （NICA） red shifted about 40 nm. The color of MICA changed from red to blue-violet. This method simplifies the preparation of photonic crystal material which is an efficient substance for developing high performance chemical/biological sensors.

Keywords Photonic crystal; Colloidal array; Molecular imprinting; p-Nitrophenol

（Received 25 June 2011;accepted 19 August 2011）