離子交換固相萃取超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物組織中的8類非甾體抗炎藥殘留

摘 要 采用離子交換固相萃取超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定了動(dòng)物組織中的8類14種非甾體抗炎藥（Nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）殘留。動(dòng)物組織樣品經(jīng)乙腈乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取、乙腈飽和正己烷除脂、Oasis MCX陽(yáng)離子交換固相萃取柱除雜后，用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀電噴霧電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。本方法的檢出限為3.0～10.0

SymbolmA@ g/kg; 定量限為10.0～25.0

SymbolmA@ g/kg; 添加濃度在10.0～1000.0

SymbolmA@ g/kg范圍內(nèi)，牛肉組織中的回收率為62.9%～108.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%；豬肉組織中的回收率為63.4%～117.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9%。

關(guān)鍵詞 非甾體抗炎藥; 離子交換固相萃取; 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜; 多殘留; 動(dòng)物組織

1 引 言

非甾體抗炎藥（Nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）是一類不含甾體結(jié)構(gòu)的化學(xué)藥物，其作用機(jī)制主要是通過(guò)與環(huán)氧化酶結(jié)合，阻斷花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛、消炎和解熱作用，主要用于哺乳動(dòng)物乳腺炎、關(guān)節(jié)炎及運(yùn)動(dòng)性損傷的治療。因療效顯著，成為繼抗生素后全球用量最大的獸藥。

近年來(lái)，有關(guān)NSAIDs不良反應(yīng)的報(bào)道逐漸增多，主要是引起腸胃道損傷等，其殘留問(wèn)題也逐漸引起重視，部分NSAIDs的最大允許殘留限量已被制訂，并已開發(fā)配套的檢測(cè)方法。目前，報(bào)道的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法和分光光度法等。其中，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因其高靈敏度和高選擇性，成為NSAIDs殘留分析中最常用的手段之一。Jedziniak等建立了動(dòng)物組織中10種NSAIDs的檢測(cè)方法。彭濤等建立了豬肝中18種NSAIDs的殘留分析方法。后者雖然分析藥物數(shù)量較多，但缺少吡唑酮類、非酸類以及環(huán)氧化酶2抑制劑的昔布類，對(duì)于NSAIDs的多殘留分析，方法擴(kuò)展性不足。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增了分析物和動(dòng)物源性食品種類，以化學(xué)結(jié)構(gòu)為分類依據(jù)，選取代表NSAIDs的全部8類的14種藥物。深入探討前處理步驟，優(yōu)化提取劑，選用陽(yáng)離子交換固相萃取柱除雜，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立了牛肉和豬肉組織中NSAIDs多殘留同時(shí)分析方法。本方法簡(jiǎn)便、可靠，靈敏度滿足國(guó)際上對(duì)動(dòng)物源食品中NSAIDs殘留限量的要求，適用于多種動(dòng)物源食品基質(zhì)，分析目標(biāo)物還具有擴(kuò)展性。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

AcquityTM UPLC超高效液相色譜儀，TQ detector三重四極桿質(zhì)譜儀，Masslynx 4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；AcquityTM UPLC BEH C18 （50 mm ×2.1 mm i d，1.7

SymbolmA@ m）色譜柱，OasisMCX（6 mL，150 mg）固相萃取柱（美國(guó)Waters公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：雙水楊酯（Sasapyrin， SAS），尼美舒利（Nimesulide，NIM），卡洛芬（Carprofen，CPF），氟芬那酸（Flufenamic acid，F(xiàn)LA），非那西丁（Phenacetin，PNT），芐達(dá)明（Benzydamine，BEN），吡羅昔康（Piroxicam，PIR），雙氯酚酸（Diclofenac，DC），布洛芬（Ibuprofen，IPF），苯基丁氮酮（Phenylbutazone，PBZ），塞來(lái)昔布（Celebrex，CEL），甲氯芬那酸（Meclofenamic acid，MEC），氟比洛芬（Flurbiprofen，F(xiàn)PF），維達(dá)洛芬（Vedaprofen，VPF），純度≥99%，均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、乙酸銨（HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司）；氨水、H3PO4、無(wú)水Na2SO4（分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司）；其它試劑均為優(yōu)級(jí)純。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件

2.2.1 液相色譜條件 柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10

SymbolmA@ L；流動(dòng)相：乙腈和0.1%甲酸溶液（含0.5 mmol/L醋酸銨）；梯度洗脫：0 min，50%乙腈；2 min，70%乙腈；3 min，80%乙腈；4 min，90%乙腈； 5 min， 50%乙腈。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正、負(fù)離子掃描（ESI＋， ESI－）；毛細(xì)管電壓：ESI＋為3.0 kV，ESI－為2.5 kV；源溫度：120 ℃；去溶劑溫度：350 ℃；錐孔氣流：氮?dú)猓?00 L/h；去溶劑氣流：氮?dú)猓?00 L/h；碰撞氣壓：氬氣，2.40×10－6 Pa；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)條件見表1。

動(dòng)物組織中的8類非甾體抗炎藥殘留 

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 提取 稱取約5.0 g試樣（精確至0.1 mg）于50 mL離心管中，加入2 g無(wú)水Na2SO4，再加入20 mL乙腈乙酸乙酯（1∶1，V/V），渦旋30 s，振蕩20 min，超聲10 min后，過(guò)濾，收集濾液于100 mL雞心瓶中，殘?jiān)?0 mL乙腈乙酸乙酯（1∶1，V/V）重復(fù)提取一次。合并濾液，于40 ℃水浴減壓旋蒸濃縮至近干。殘留物用2 mL乙腈超聲助溶后，用0.02 mol/L H3PO4定容至10 mL，加入10 mL乙腈飽和正己烷振蕩10 min，靜置15 min，取下層溶液待凈化。

2.3.2 凈化

Oasis MCX固相萃取柱依次用10 mL甲醇、水、0.02 mol/L H3PO4平衡后，再轉(zhuǎn)入上述提取液，在重力作用下，保持其流速約為1 mL/min，待提取液完全通過(guò)后，用5 mL正己烷乙酸乙酯（9∶1，V/V）淋洗，自然流干后，用3 mL 甲醇和3 mL 氨水甲醇（5∶95，V/V）洗脫，收集洗脫液，于40 ℃中氮吹至近干，加0.5 mL乙腈超聲助溶后，用0.1%甲酸（含0.5 mmol/L醋酸銨）定容至1 mL，混勻后過(guò)0.2

SymbolmA@ m尼龍濾膜，待檢測(cè)。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用初始比例流動(dòng)相稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制濃度分別為10.0， 20.0， 25.0， 50.0， 100， 125， 200， 400， 500和1000

SymbolmA@ g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.2節(jié)儀器條件下測(cè)定，平行測(cè)定3次。以定量子離子峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（x），進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取方法的優(yōu)化

本研究涉及的14種分析目標(biāo)物涵蓋了全部8類NSAIDs：水楊酸類（SAS）、吡唑酮類（PNT）、芳基烷酸苯乙酸類（DC）、芳基烷酸吲哚乙酸類（BEN）、芳基烷酸丙酸類（CPF， VPF， IPF， FPF）、甲酸類（FLA， MEC）、乙酰苯胺類（PBZ）、昔布類（CEL）、昔康類（PIR）和其它類（NIM）。除IPF和PNT外，分子結(jié)構(gòu)中都有兩個(gè)苯環(huán)或雜環(huán)（結(jié)構(gòu)見圖1），非極性較大，且pKa值普遍大于文獻(xiàn)的藥物，在酸化乙腈（乙腈 H3PO4，80∶1，V/V，pH 4.5）中以離子態(tài)居多，不易溶于有機(jī)試劑，與文獻(xiàn)報(bào)道的IPF， CPF等在酸化乙腈中的提取率低于乙腈的結(jié)論一致，故本研究選用中等極性有機(jī)試劑為提取劑，分別對(duì)乙腈（ACN）、乙酸乙酯（EtAc）、乙腈丙酮（ACNPT，1∶1，V/V）和乙腈乙酸乙酯（ACNEtAC，1∶1，V/V）進(jìn)行比較。在同等條件下，ACNEtAC（1∶1，V/V）的提取率顯著高于其它溶液（結(jié)果見圖2），且該提取溶液具有一定的脫脂和沉淀蛋白的作用。

3.2 固相萃取柱的選擇

采用液液分配法除脂后，結(jié)合固相萃取能更好地除雜。根據(jù)前期研究，Si柱和HLB柱對(duì)NSAIDs都有很好的凈化和吸附能力，但基質(zhì)效應(yīng)明顯。有研究報(bào)道，pKa值在2～10的化合物，可選用離子交換柱。因此，本研究對(duì)Oasis MCX和Oasis MAX的使用效果進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DC， FLA和MEC結(jié)構(gòu)中含有二苯氨基（pKa 0.85），在MAX中保留很強(qiáng)，難于洗脫；BEN溶液呈弱堿性，在MAX上很難保留；大部分NSAIDs都含有N， Cl， S等電負(fù)性原子，易于得到質(zhì)子，從而在MCX上保留。進(jìn)一步優(yōu)化MCX的洗脫條件發(fā)現(xiàn)，氨化甲醇對(duì)FLA和CEL的洗脫能力明顯優(yōu)于氨化乙腈。可能是藥物結(jié)構(gòu)中的F原子與MCX骨架上的N乙烯吡咯烷酮結(jié)構(gòu)形成氫鍵，乙腈是非質(zhì)子溶劑，雖極性大于甲醇，但破壞氫鍵的能力卻不如甲醇。通過(guò)優(yōu)化洗脫溶液的組成和體積，確定依次用3 mL甲醇和3 mL甲醇氨水（95∶5， V/V），能最大程度洗脫NSAIDs。實(shí)驗(yàn)表明，MCX在去除引起離子抑制效應(yīng)的主要物質(zhì)——磷脂方面較Si和HLB柱優(yōu)勢(shì)明顯，凈化效果滿足LCMS/MS測(cè)定要求。添加樣品的質(zhì)量色譜圖見圖3，在藥物出峰位置處沒有干擾。

3.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

根據(jù)前期研究，甲酸可提高藥物在ESI＋模式下的電離效率，促使＋生成；乙酸銨能改變流動(dòng)相的pH值，促進(jìn)酸性化合物在ESI模式中形成較強(qiáng)的分子離子，并有效減少＋生成。本研究以乙腈0.1%甲酸溶液（含0.5 mmol/L醋酸銨）為流動(dòng)相，優(yōu)化洗脫梯度，將分析時(shí)間由15 min縮短至5 min。采用流動(dòng)注射方式，考察藥物的MRM的響應(yīng)。大部分NSAIDs形成＋或－分子離子，并在二級(jí)質(zhì)譜中，產(chǎn)生兩個(gè)較為穩(wěn)定的子離子。而芳基烷酸丙酸類NSAIDs比較特殊：FPF的＋準(zhǔn)分子離子峰的響應(yīng)明顯強(qiáng)于＋；CPF由于氯同位素的存在而產(chǎn)生兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的＋準(zhǔn)分子離子峰，IPF的＋和＋準(zhǔn)分子離子峰響應(yīng)都很高，但兩種藥物在二級(jí)質(zhì)譜中，都只有去除羧基后形成的子離子能穩(wěn)定存在。3種藥物的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖見圖4。

進(jìn)一步優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使各NSAIDs的響應(yīng)最大化。在質(zhì)譜掃描速度一定的情況下，將MRM分為3個(gè)掃描時(shí)間段，以確保每個(gè)色譜峰的掃描點(diǎn)數(shù)。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、準(zhǔn)確度和精密度

本研究采用外標(biāo)法定量，通過(guò)向陰性樣品中添加NSAIDs來(lái)考察方法的檢出限（S/N＝3）、定量限、（S/N＝10）準(zhǔn)確度和精密度。在線性范圍內(nèi)，選擇定量限的20倍、5倍和1倍3個(gè)濃度進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，方法回收率在62.9%～117.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.3%。各藥物的曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和回收率見表1和表2。

3.5 小結(jié)

本研究采用陽(yáng)離子交換固相萃取，結(jié)合UPLCMS/MS技術(shù)建立了動(dòng)物組織中8類14種 NSAIDs多殘留同時(shí)分析方法。本方法簡(jiǎn)便、可靠，靈敏度滿足國(guó)際上對(duì)動(dòng)物源食品中NSAIDs殘留限量的要求，適用于多種動(dòng)物源食品基質(zhì)的檢測(cè)。

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References

1 XUAN YunXia， WANG MingWei. Chinese Sic. Bul.， 2005， 17（1）: 10～14

宣云遐， 王明偉. 生命科學(xué)， 2005， 17（1）: 10～14

2 HU Ting， PENG Tao， DENG XiaoJun， ZHANG XiWen， SHEN JianZhong， JIANG HaiYang. Chinese J. Vet. Drug， 2010， 44（8）: 42～47

胡 婷， 彭 濤， 鄧曉軍， 張習(xí)文， 沈建忠， 江海洋.中國(guó)獸藥雜志， 2010， 44（8）: 42～47

3 PENG Tao. SNT 19922007， Determination of Residues of Paracetamol and Acetylsalicylic acid in Foodstuffs of Animal Origin for Import and Export—LCMS/MS method

彭 濤. SNT 19922007， 進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中對(duì)乙酰氨基酚、鄰乙酰水楊酸殘留量的檢測(cè)方法液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法

4 Jedziniak P， SzprengierJuszkiewicz T， Olejnik M， Ｚmudzki J. Anal. Chim. Acta， 2010， 672（12）: 85～92

5 PENG Tao， YU Jing， YAN Mao， LI XiaoJuan， CHEN DongDong， DAI HanHui， GUO Wei， LI ShuJuan， TANG YingZhang. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（3）: 363～368

彭 濤， 于 靜， 嚴(yán) 矛， 李曉娟， 陳冬東， 代漢慧， 國(guó) 偉， 李淑娟， 唐英章. 分析化學(xué)， 2009， 37（3）: 363～368



Ion Exchange Solid Phase Extraction Coupled with Liquid

Chromatography Tandem Mass Spectrometry for

Determination of 8 Classes of Nonsteroidal Anti

inflammatory Drugs Residues in Animal Tissues



HU Ting1， PENG Tao2， LI XiaoJuan2， CHEN DongDong2， DAI HanHui2， ZHOU YueNing3，

XIA Xi1， DING ShuangYang1， ZHU AiLing1， JIANG HaiYang*1



1（Colleage of Veterinary Medicine at China Agricultural University， Beijing 100193）

2（Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123）

3（College of Chemistry Chemical Engineering of Shanxi University， Taiyuan 030006）