離子交換固相萃取超高效液相色譜串聯質譜法同時測定動物組織中的8類非甾體抗炎藥殘留

摘 要 采用離子交換固相萃取超高效液相色譜串聯質譜法同時測定了動物組織中的8類14種非甾體抗炎藥（Nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）殘留。動物組織樣品經乙腈乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取、乙腈飽和正己烷除脂、Oasis MCX陽離子交換固相萃取柱除雜后，用液相色譜質譜聯用儀電噴霧電離，多反應監測模式檢測。本方法的檢出限為3.0～10.0

SymbolmA@ g/kg; 定量限為10.0～25.0

SymbolmA@ g/kg; 添加濃度在10.0～1000.0

SymbolmA@ g/kg范圍內，牛肉組織中的回收率為62.9%～108.4%，相對標準偏差小于10%；豬肉組織中的回收率為63.4%～117.0%，相對標準偏差小于9%。

關鍵詞 非甾體抗炎藥; 離子交換固相萃取; 超高效液相色譜串聯質譜; 多殘留; 動物組織

1 引 言

非甾體抗炎藥（Nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）是一類不含甾體結構的化學藥物，其作用機制主要是通過與環氧化酶結合，阻斷花生四烯酸轉化為前列腺素，從而發揮鎮痛、消炎和解熱作用，主要用于哺乳動物乳腺炎、關節炎及運動性損傷的治療。因療效顯著，成為繼抗生素后全球用量最大的獸藥。

近年來，有關NSAIDs不良反應的報道逐漸增多，主要是引起腸胃道損傷等，其殘留問題也逐漸引起重視，部分NSAIDs的最大允許殘留限量已被制訂，并已開發配套的檢測方法。目前，報道的檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜串聯質譜法、氣相色譜串聯質譜法、毛細管電泳法、薄層色譜法和分光光度法等。其中，液相色譜串聯質譜法因其高靈敏度和高選擇性，成為NSAIDs殘留分析中最常用的手段之一。Jedziniak等建立了動物組織中10種NSAIDs的檢測方法。彭濤等建立了豬肝中18種NSAIDs的殘留分析方法。后者雖然分析藥物數量較多，但缺少吡唑酮類、非酸類以及環氧化酶2抑制劑的昔布類，對于NSAIDs的多殘留分析，方法擴展性不足。

本實驗在前期研究的基礎上，擴增了分析物和動物源性食品種類，以化學結構為分類依據，選取代表NSAIDs的全部8類的14種藥物。深入探討前處理步驟，優化提取劑，選用陽離子交換固相萃取柱除雜，有效降低了基質效應，結合超高效液相色譜串聯質譜儀，建立了牛肉和豬肉組織中NSAIDs多殘留同時分析方法。本方法簡便、可靠，靈敏度滿足國際上對動物源食品中NSAIDs殘留限量的要求，適用于多種動物源食品基質，分析目標物還具有擴展性。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

AcquityTM UPLC超高效液相色譜儀，TQ detector三重四極桿質譜儀，Masslynx 4.1 數據處理系統（美國Waters公司）；AcquityTM UPLC BEH C18 （50 mm ×2.1 mm i d，1.7

SymbolmA@ m）色譜柱，OasisMCX（6 mL，150 mg）固相萃取柱（美國Waters公司）。

標準品：雙水楊酯（Sasapyrin， SAS），尼美舒利（Nimesulide，NIM），卡洛芬（Carprofen，CPF），氟芬那酸（Flufenamic acid，FLA），非那西丁（Phenacetin，PNT），芐達明（Benzydamine，BEN），吡羅昔康（Piroxicam，PIR），雙氯酚酸（Diclofenac，DC），布洛芬（Ibuprofen，IPF），苯基丁氮酮（Phenylbutazone，PBZ），塞來昔布（Celebrex，CEL），甲氯芬那酸（Meclofenamic acid，MEC），氟比洛芬（Flurbiprofen，FPF），維達洛芬（Vedaprofen，VPF），純度≥99%，均購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、乙酸銨（HPLC級，美國Fisher公司）；氨水、H3PO4、無水Na2SO4（分析純，北京北化精細化學品有限公司）；其它試劑均為優級純。

2.2 實驗條件

2.2.1 液相色譜條件 柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：10

SymbolmA@ L；流動相：乙腈和0.1%甲酸溶液（含0.5 mmol/L醋酸銨）；梯度洗脫：0 min，50%乙腈；2 min，70%乙腈；3 min，80%乙腈；4 min，90%乙腈； 5 min， 50%乙腈。

2.2.2 質譜條件 電噴霧離子源，正、負離子掃描（ESI＋， ESI－）；毛細管電壓：ESI＋為3.0 kV，ESI－為2.5 kV；源溫度：120 ℃；去溶劑溫度：350 ℃；錐孔氣流：氮氣，100 L/h；去溶劑氣流：氮氣，600 L/h；碰撞氣壓：氬氣，2.40×10－6 Pa；監測模式：多反應監測，監測條件見表1。

動物組織中的8類非甾體抗炎藥殘留 

2.3 實驗方法

2.3.1 提取 稱取約5.0 g試樣（精確至0.1 mg）于50 mL離心管中，加入2 g無水Na2SO4，再加入20 mL乙腈乙酸乙酯（1∶1，V/V），渦旋30 s，振蕩20 min，超聲10 min后，過濾，收集濾液于100 mL雞心瓶中，殘渣用20 mL乙腈乙酸乙酯（1∶1，V/V）重復提取一次。合并濾液，于40 ℃水浴減壓旋蒸濃縮至近干。殘留物用2 mL乙腈超聲助溶后，用0.02 mol/L H3PO4定容至10 mL，加入10 mL乙腈飽和正己烷振蕩10 min，靜置15 min，取下層溶液待凈化。

2.3.2 凈化

Oasis MCX固相萃取柱依次用10 mL甲醇、水、0.02 mol/L H3PO4平衡后，再轉入上述提取液，在重力作用下，保持其流速約為1 mL/min，待提取液完全通過后，用5 mL正己烷乙酸乙酯（9∶1，V/V）淋洗，自然流干后，用3 mL 甲醇和3 mL 氨水甲醇（5∶95，V/V）洗脫，收集洗脫液，于40 ℃中氮吹至近干，加0.5 mL乙腈超聲助溶后，用0.1%甲酸（含0.5 mmol/L醋酸銨）定容至1 mL，混勻后過0.2

SymbolmA@ m尼龍濾膜，待檢測。

2.3.3 標準曲線

用初始比例流動相稀釋混合標準工作液，配制濃度分別為10.0， 20.0， 25.0， 50.0， 100， 125， 200， 400， 500和1000

SymbolmA@ g/L的標準溶液，在2.2節儀器條件下測定，平行測定3次。以定量子離子峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（x），進行回歸分析，得標準曲線、回歸方程、線性范圍、相關系數。

3 結果與討論

3.1 提取方法的優化

本研究涉及的14種分析目標物涵蓋了全部8類NSAIDs：水楊酸類（SAS）、吡唑酮類（PNT）、芳基烷酸苯乙酸類（DC）、芳基烷酸吲哚乙酸類（BEN）、芳基烷酸丙酸類（CPF， VPF， IPF， FPF）、甲酸類（FLA， MEC）、乙酰苯胺類（PBZ）、昔布類（CEL）、昔康類（PIR）和其它類（NIM）。除IPF和PNT外，分子結構中都有兩個苯環或雜環（結構見圖1），非極性較大，且pKa值普遍大于文獻的藥物，在酸化乙腈（乙腈 H3PO4，80∶1，V/V，pH 4.5）中以離子態居多，不易溶于有機試劑，與文獻報道的IPF， CPF等在酸化乙腈中的提取率低于乙腈的結論一致，故本研究選用中等極性有機試劑為提取劑，分別對乙腈（ACN）、乙酸乙酯（EtAc）、乙腈丙酮（ACNPT，1∶1，V/V）和乙腈乙酸乙酯（ACNEtAC，1∶1，V/V）進行比較。在同等條件下，ACNEtAC（1∶1，V/V）的提取率顯著高于其它溶液（結果見圖2），且該提取溶液具有一定的脫脂和沉淀蛋白的作用。

3.2 固相萃取柱的選擇

采用液液分配法除脂后，結合固相萃取能更好地除雜。根據前期研究，Si柱和HLB柱對NSAIDs都有很好的凈化和吸附能力，但基質效應明顯。有研究報道，pKa值在2～10的化合物，可選用離子交換柱。因此，本研究對Oasis MCX和Oasis MAX的使用效果進行了比較。結果發現：DC， FLA和MEC結構中含有二苯氨基（pKa 0.85），在MAX中保留很強，難于洗脫；BEN溶液呈弱堿性，在MAX上很難保留；大部分NSAIDs都含有N， Cl， S等電負性原子，易于得到質子，從而在MCX上保留。進一步優化MCX的洗脫條件發現，氨化甲醇對FLA和CEL的洗脫能力明顯優于氨化乙腈。可能是藥物結構中的F原子與MCX骨架上的N乙烯吡咯烷酮結構形成氫鍵，乙腈是非質子溶劑，雖極性大于甲醇，但破壞氫鍵的能力卻不如甲醇。通過優化洗脫溶液的組成和體積，確定依次用3 mL甲醇和3 mL甲醇氨水（95∶5， V/V），能最大程度洗脫NSAIDs。實驗表明，MCX在去除引起離子抑制效應的主要物質——磷脂方面較Si和HLB柱優勢明顯，凈化效果滿足LCMS/MS測定要求。添加樣品的質量色譜圖見圖3，在藥物出峰位置處沒有干擾。

3.3 檢測條件的優化

根據前期研究，甲酸可提高藥物在ESI＋模式下的電離效率，促使＋生成；乙酸銨能改變流動相的pH值，促進酸性化合物在ESI模式中形成較強的分子離子，并有效減少＋生成。本研究以乙腈0.1%甲酸溶液（含0.5 mmol/L醋酸銨）為流動相，優化洗脫梯度，將分析時間由15 min縮短至5 min。采用流動注射方式，考察藥物的MRM的響應。大部分NSAIDs形成＋或－分子離子，并在二級質譜中，產生兩個較為穩定的子離子。而芳基烷酸丙酸類NSAIDs比較特殊：FPF的＋準分子離子峰的響應明顯強于＋；CPF由于氯同位素的存在而產生兩個響應較強的＋準分子離子峰，IPF的＋和＋準分子離子峰響應都很高，但兩種藥物在二級質譜中，都只有去除羧基后形成的子離子能穩定存在。3種藥物的一級、二級質譜圖見圖4。

進一步優化毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數，使各NSAIDs的響應最大化。在質譜掃描速度一定的情況下，將MRM分為3個掃描時間段，以確保每個色譜峰的掃描點數。

3.4 標準曲線、線性范圍、相關系數、檢出限、定量限、準確度和精密度

本研究采用外標法定量，通過向陰性樣品中添加NSAIDs來考察方法的檢出限（S/N＝3）、定量限、（S/N＝10）準確度和精密度。在線性范圍內，選擇定量限的20倍、5倍和1倍3個濃度進行添加回收實驗，方法回收率在62.9%～117.0%之間，相對標準偏差小于9.3%。各藥物的曲線回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限、定量限和回收率見表1和表2。

3.5 小結

本研究采用陽離子交換固相萃取，結合UPLCMS/MS技術建立了動物組織中8類14種 NSAIDs多殘留同時分析方法。本方法簡便、可靠，靈敏度滿足國際上對動物源食品中NSAIDs殘留限量的要求，適用于多種動物源食品基質的檢測。

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2（Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123）

3（College of Chemistry Chemical Engineering of Shanxi University， Taiyuan 030006）