高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜和水果中氟嗎啉的殘留量

摘 要 建立了高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）分析蔬菜和水果中氟嗎啉殘留量檢測(cè)的方法。通過(guò)氟嗎啉光照實(shí)驗(yàn)，研究了氟嗎啉順?lè)串悩?gòu)體轉(zhuǎn)化規(guī)律。以醚菌胺為內(nèi)標(biāo)（I.S.），乙酸乙酯提取，經(jīng)HLB（親水疏水凈化住）固相萃取小柱凈化并富集后，以液相色譜分離，采用質(zhì)譜正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定量分析。方法定量限為 0.05

SymbolmA@ g/kg；線性范圍為 0.05～25

SymbolmA@ g/kg；提取回收率為 77.64%～92.83%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.6%。本方法靈敏度高、選擇性好，實(shí)際樣品檢測(cè)中的檢出率達(dá)到70%；樣品中最高殘留量為1.83

SymbolmA@ g/kg，能滿(mǎn)足蔬菜和水果中氟嗎啉殘留量檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜質(zhì)譜； 轉(zhuǎn)化； 氟嗎啉； 蔬菜； 水果

1 引 言

氟嗎啉（Flumorph）是沈陽(yáng)化工研究院開(kāi)發(fā)的我國(guó)第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的肉桂酰胺類(lèi)殺菌劑\\。氟嗎啉【（E，Z）4\\嗎啉】（圖1）中氟原子具有模擬效應(yīng)、電子效應(yīng)阻礙效應(yīng)、滲透效應(yīng)，使其防病殺菌作用倍增，活性顯著高于同類(lèi)產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于防治黃瓜和葡萄霜霉病、辣椒疫病、蕃茄晚疫病等。現(xiàn)階段蔬菜和水果中氟嗎啉殘留的分析方法的研究較少，各國(guó)均未制定蔬菜和水果中氟嗎啉的最高限量標(biāo)準(zhǔn)（MRL）。因此急需建立高效、準(zhǔn)確、靈敏的蔬菜和水果中氟嗎啉殘留的分析方法。 圖1 氟嗎啉的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fig．1 Chemical structure of flumorph

目前，氟嗎啉殘留分析的研究相對(duì)較少，主要應(yīng)用液相色譜紫外聯(lián)用技術(shù)（HPLCUV）。羅爽等\\采用高效液相色譜紫外聯(lián)用技術(shù)研究了土壤中氟嗎啉的降解和殘留，方法的線性范圍在 0.1～5.0 mg/L。Hu等\\建立了固相萃取液相色譜紫外聯(lián)用分析蔬菜、土壤和地下水中氟嗎啉殘留的方法，方法定量限為 10

SymbolmA@ g/kg。但是，液相色譜紫外聯(lián)用技術(shù)存在靈敏度低、選擇性差、容易產(chǎn)生假陽(yáng)性等缺陷。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)靈敏度高， 選擇性強(qiáng)，近幾年廣泛應(yīng)用于蔬菜和水果中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的研究\\。最近，Tian等\\采用LCMS/MS測(cè)定牛奶中 29種農(nóng)藥殘留，線性范圍為3.9～30

SymbolmA@ g/kg，氟嗎啉的定量限為 1.0

SymbolmA@ g/kg。

本研究以醚菌胺為內(nèi)標(biāo)，建立了LCMS/MS測(cè)定蔬菜和水果中氟嗎啉殘留量的分析方法。通過(guò)氟嗎啉光照實(shí)驗(yàn)，研究了氟嗎啉順?lè)串悩?gòu)體相互轉(zhuǎn)化的規(guī)律，并確定兩種異構(gòu)體的色譜行為。本方法處理過(guò)程簡(jiǎn)便、回收率高，并采用二級(jí)質(zhì)譜掃描定量，定量限為 0.05

SymbolmA@ g/kg，低于文獻(xiàn)\\報(bào)道的50倍，并成功應(yīng)用于葡萄、草莓、黃瓜和番茄等實(shí)際樣品的氟嗎啉殘留分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

三重四級(jí)質(zhì)譜儀API 4000（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；液相色譜儀LC 20A（日本島津公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；氮吹儀；離心機(jī)； OASIS HLB （30 g/L） 固相萃取柱（Waters 公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品醚菌胺（≥97%， Sigma公司）; 氟嗎啉（≥99.8%，沈陽(yáng)化工研究院有限公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，F(xiàn)isher公司）;甲酸、氨水、NaOH、Na2CO3、HCl（分析純）;實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取氟嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g于100 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解并定容，混勻，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。精確量取氟嗎啉儲(chǔ)備液 1 mL于 100 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，配制成 1000

SymbolmA@ g/L中間溶液。精確稱(chēng)取適量?jī)?nèi)標(biāo)物醚菌胺，以甲醇溶解，配制成 20

SymbolmA@ g/L溶液。以上溶液均于－18 ℃避光保存。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

Symmetry C18色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5

SymbolmA@ m， Waters公司）。流動(dòng)相A為水，B為甲醇；線性梯度洗脫程序：0～2 min，12% B；2～22 min，12%～52% B；22～30 min，52%～90% B；30～33 min，90%～12% B；33～35 min，12% B。流速：0.25 mL/min；柱溫：35 ℃。進(jìn)樣體積25

SymbolmA@ L。

表1 氟嗎啉和內(nèi)標(biāo)物醚菌胺的質(zhì)譜參數(shù)

Table 1 MS/MS parameters for determination of flumorph and dimoxystrobin （I.S.）

化合物Compound母離子Parention

（m/z）子離子Daughterion（m/z）碰撞能Collision

energy（eV）去簇電壓Declustering

potential（V）氟嗎啉Flumorph371.9284.9*164.8264481

81

醚菌胺Dimoxystrobin327.3205.0*

115.9142650

50 * 定量離子（Quatitative ions）。

電噴霧離子源（ESI）， 正離子掃描， 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）， 電噴霧電壓（IS）：5.5 kV；霧化氣壓力（GS1）： 448 kPa；氣簾氣壓力（CUR）： 69 kPa；輔助氣壓力（GS2）： 448 kPa；離子源溫度（TEM）： 550 ℃；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量（CE）及去簇電壓（DP）見(jiàn)表1。

2.4 樣品前處理稱(chēng)取20 g（精確至 0.01 g）樣品，切塊、勻漿，備用；準(zhǔn)確稱(chēng)取4.00 g（精確至 0.01 g）勻漿樣品于 50 mL塑料離心管中，加100

SymbolmA@ L（20

SymbolmA@ g/L）內(nèi)標(biāo)物醚菌胺，加 100

SymbolmA@ L 1 mol/L Na2CO3溶液混勻；再加10 mL 乙酸乙酯旋渦混勻，超聲 5 min，高速振蕩 10 min，以 12000 r/min離心 5 min，收集上清液于 50 mL梨形瓶中。以10 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并上清液，于45 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，以5 mL蒸餾水溶解，待凈化；以6 mL甲醇活化，6 mL純水平衡HLB 固相萃取柱，將收集的上清液過(guò)柱，以4 mL 5%甲醇水溶液淋洗一次，抽干。以3 mL甲醇洗脫，洗脫液于45 ℃以氮?dú)獯抵两桑? mL甲醇溶解，過(guò)0.22

SymbolmA@ m濾膜， 待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 氟嗎啉順?lè)串悩?gòu)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

氟嗎啉為烯酰嗎啉中氯原子被氟取代的化合物，烯酰嗎啉反式結(jié)構(gòu)空間位阻大于順式結(jié)構(gòu)，在光照下可互變，80%變?yōu)橄徇‥）\\。據(jù)此推斷等量順?lè)串悩?gòu)體的氟嗎啉在日光照射下， 順式結(jié)構(gòu)可向反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。在光照條件下，通過(guò)氟嗎啉順?lè)串悩?gòu)體濃度的變化，本實(shí)驗(yàn)研究了其相互轉(zhuǎn)化的規(guī)律，從而確定異構(gòu)體的色譜行為。取50 mL 500

SymbolmA@ g/L氟嗎啉標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞玻璃試管中，在室溫和自然光照射條件下，間隔一定時(shí)間取少量溶液分析， 結(jié)果見(jiàn)圖2。在充足陽(yáng)光照射下，氟嗎啉異構(gòu)體之間轉(zhuǎn)化速度很快，60 min 轉(zhuǎn)化反應(yīng)接近終點(diǎn)，其中一種異構(gòu)體濃度隨著照射時(shí)間延長(zhǎng)而增大，推測(cè)為氟嗎啉（E）。在色譜圖上保留時(shí)間為27.03 min; 另一種異構(gòu)體濃度降低，推測(cè)為氟嗎啉（Z），保留時(shí)間為26.40 min; 氟嗎啉總量相對(duì)穩(wěn)定。結(jié)果表明，在光照條件下，氟嗎啉的順?lè)串悩?gòu)體可相互轉(zhuǎn)化，短時(shí)間氟嗎啉降解速度緩慢。因此，本研究采用氟嗎啉總量定量的方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

不同流動(dòng)相對(duì)氟嗎啉和內(nèi)標(biāo)物醚菌胺分子質(zhì)子化和色譜分離有一定程度的影響。比較了乙腈水和甲醇水為流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響。以乙腈水為流動(dòng)相時(shí)，質(zhì)譜的信號(hào)較低， 且梯度洗脫時(shí)氟嗎啉順?lè)串悩?gòu)體分離效果差；以甲醇水為流動(dòng)相時(shí)，質(zhì)譜的信號(hào)明顯提高，峰形對(duì)稱(chēng)，且異構(gòu)體完全分離。同時(shí)考察了在甲醇水中添加不同量的甲酸（0， 0.1%， 0.3%）對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響。未添加甲酸時(shí)，質(zhì)譜信號(hào)最高；隨著添加量增加，信號(hào)降低。推斷H＋對(duì)氟嗎啉離子化有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)選擇不添加甲酸的甲醇水作為流動(dòng)相。圖 3為番茄空白、番茄加標(biāo)和番茄樣品的MRM色譜圖。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在流動(dòng)注射狀態(tài)下，分別將 1 mg/L的氟嗎啉和醚菌胺的甲醇溶液在正、負(fù)兩種離子掃描模式對(duì)比，進(jìn)行全掃描，以選擇分子離子峰和電離方式。結(jié)果表明：在正離子模式下， \\＋為最強(qiáng)峰，選擇其作為母離子。在二級(jí)質(zhì)譜掃描過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)碰撞能（CE）和去簇電壓（DP），選擇豐度最高，干擾較小的子離子為定量離子，豐度次之的為定性離子。氟嗎啉和醚菌胺的質(zhì)譜條件見(jiàn)表 1，其質(zhì)譜裂解過(guò)程見(jiàn)圖 4。

3.4 樣品的提取液的選擇

氟嗎啉和內(nèi)標(biāo)物醚菌胺為脂溶性化合物，易溶于乙酸乙酯、二氯甲烷和乙醚。本研究對(duì)3種提取液的提取效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，乙酸乙酯的提取效果最好，不同基質(zhì)的提取回收率均高于70%；二氯甲烷次之；乙醚提取效果最差。因此選用乙酸乙酯作為提取液。

氟嗎啉和醚菌胺均為堿性化合物，在提取時(shí)，加入適量堿性物質(zhì)，有利于提取回收率的提高。本研究在提取液中添加適量的NaOH或Na2CO3，結(jié)果表明， 添加Na2CO3的提取回收率略高。比較了Na2CO3的加入量對(duì)提取回收率的影響，確定了在加入乙酸乙酯前，先添加100

SymbolmA@ L 1 mol/L Na2CO3，以提高提取回收率。

3.5 固相萃取柱選擇

氟嗎啉和醚菌胺為弱極性化合物，可采用反相萃取柱HLB、MAX（混合陰離子交換柱）和MCX（混合陽(yáng)離子交換柱）等。HLB小柱是一種新型的基于反相色譜保留機(jī)理的固相萃取柱，其填料為親脂性二乙烯苯和親水性N乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，具有比其它萃取小柱更高的吸附容量和更寬的pH適用范圍等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)比較了3種固相萃取小柱應(yīng)用在蔬菜和水果等不同基質(zhì)時(shí)的凈化效果。結(jié)果表明，3種固相萃取小柱均能達(dá)到去除干擾的目的，但是HLB小柱提取回收率最高。因此，選擇HLB小柱用于蔬菜和水果樣品中氟嗎啉的富集凈化。

3.6 定量限及線性范圍

分別稱(chēng)取 6份不同基質(zhì)的空白樣品各 4.00 g 置于 50 mL 塑料離心管中， 加入氟嗎啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成 0，0.05，0.25，5.0，12.5和25.0

SymbolmA@ g/kg的系列樣品， 按 2.4節(jié)進(jìn)行操作，以氟嗎啉與醚菌胺的峰面積比值為縱坐標(biāo)，以氟嗎啉的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，加權(quán)計(jì)算線性回歸方程。其回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）見(jiàn)表 2，氟嗎啉在0.05～25

SymbolmA@ g/kg范圍具有良好的線性關(guān)系，以信噪比（S/N）為 10進(jìn)行計(jì)算。不同基質(zhì)中氟嗎啉的定量檢出限為0.05

SymbolmA@ g/kg。

3.7 回收率、精確度

分別稱(chēng)取不同基質(zhì)的空白樣品各4.00 g，分別添加適量氟嗎啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度為 0.25，5.0 和 12.5

SymbolmA@ g/kg，按 2.4節(jié)進(jìn)行操作，每個(gè)濃度設(shè)定重復(fù) 6次，回收率為 77.6%～92.8%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.3%～8.6%（表 3）。

3.8 方法的穩(wěn)定性

分別稱(chēng)取不同基質(zhì)的空白樣品各 4.00 g，分別添加適量氟嗎啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度為 5.0

SymbolmA@ g/kg，5 h后按 2.4節(jié)進(jìn)行操作，每個(gè)濃度設(shè)定重復(fù) 6次，回收率為 78.3%～90.9%；RSD為 5.0%～10.6%。通過(guò)對(duì)比 3.7節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，回收率和RSD變化很小，表明本方法具有很好的穩(wěn)定性。

3.9 基質(zhì)效應(yīng)的影響?yīng)?/p>

基質(zhì)存在可能增強(qiáng)或抑制質(zhì)譜信號(hào)。可以通過(guò)基質(zhì)曲線的斜率與純標(biāo)樣曲線對(duì)比判斷基質(zhì)效應(yīng)的影響。如果基質(zhì)曲線斜率大于純標(biāo)樣曲線斜率為基質(zhì)增強(qiáng)，相反為基質(zhì)抑制。本研究以基質(zhì)信號(hào)增強(qiáng)或抑制的百分比表示基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，進(jìn)行了基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。4種基質(zhì)均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)， 其中番茄的基質(zhì)抑制效應(yīng)最強(qiáng)（－18.6%），黃瓜的基質(zhì)抑制效應(yīng)最弱（－13.3%）。

3.10 實(shí)際樣品的測(cè)定

在隨機(jī)抽查的葡萄、草莓、番茄和黃瓜共 20批次樣品中，氟嗎啉殘留檢出率高達(dá) 70%，表明氟嗎啉已廣泛應(yīng)用于蔬菜和水果病害防治。實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 4，其中 3號(hào)番茄樣品中氟嗎啉殘留量最高為1.83

SymbolmA@ g/kg，色譜圖見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法具有高靈敏度和高選擇性，適用于蔬菜和水果中殺菌劑氟嗎啉殘留分析。

References

1 LIU ChangLing. World Pesticide Encyclopedia， Fungicide. Beijing：Chemical Industry Press， 2006： 80～82

劉長(zhǎng)令. 世界農(nóng)藥大全#8226;殺菌劑卷. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版， 2006： 80～82

2 LUO Shuang， TAO ChuanJiang， PIAO XiuYing. Chinese J. Anal. Chem.，2008， 36（1）： 7～11

羅 爽， 陶傳江， 樸秀英. 分析化學(xué)， 2008， 36（1）： 7～11

3 Hu J Y， Zhang Y C， Yan H. J. AOAC Int．， 2008， 91（6）: 1459～1465

4 RomeroGonzález R， Garrido Frenich A， Martínez Vidal J L. Talanta， 2008， 76（1）: 211～225

5 Mol H G J， Van Dam R C J， Steijger O M. J. Chromatogr. A， 2003， 1015（12）: 119～127

6 Tian Q G， Giusti M M， Stoner G D， Schwartz S J. J. Chromatogr. A， 2005， 1091（12）: 72～82

7 Leandro C C， Hancock P， Fussell R J， B. Keely J. J. Chromatogr. A， 2006， 1103（1）: 94～101

8 Deák E， Gyepes A， StefanovitsBányai ， Dernovics M. Food Res. Int.， 2010， 43（10）: 2452～2455

9 Kotake Y， Okuda K， Kamizono M， Matsumoto N， Tanahashi T， Hara H， CaparrosLefebvre D， Ohta S. J. Chromatogr. B， 2004， 806（1）: 75～78

10 Pozo O J， J. Marin M， Sancho J V， Hernández F. J. Chromatogr. A， 2003， 992（12）: 133～140

11 Sagratini G， Maes J， Giardiná D， Damiani P， PicóY. J. Chromatogr. A， 2007， 1147（2）: 135～143

12 Monaci L， A. Van Hengel J. J. Chromatogr. A， 2008， 1192（1）: 113～120

13 MayerHelm B， Hofbauer L， Müller J. Talanta， 2008， 74（5）: 1184～1190

14 Tian H Z. Chemosphere， 2011， 83（3）: 349～355

15 Sannino A， Bolzoni L， Bandini M. J. Chromatogr. A， 2004， 1036（2）: 161～169

16 Zamora T， Pozo O J， López F J， Hernández F. J. Chromatogr. A， 2004， 1045（12）: 137～143



Determination of Flumorph Residues in Vegetables and

Fruits by High Performance Liquid Chromatography

Tandem Mass Spectrometry



WANG YanSong*1，2， YANG ChunHui2， ZAHNG ChunYe2， ZHANG FengQing2，

HE MingRui2， CUI XiangYong2， MA Ji2， LI HuaFeng2



1（College of Sciences， Northeastern University， Shenyang 110004）

2（Shenyang Supervision and Inspection Institute for Product Quality， Shenyang 110022）



Abstract A method was developed for the determination of flumorph residues in vegetables and fruits using dimoxystrobin as internal standard （IS） by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS） . The conversion rule between flumorph（Z） and flumorph（E） has been studied by sunlight test of flumorph. Flumorph and IS were extracted with ethyl acetate， then purified and concentrated by Oasis HLB cartridge. Qualitative and quantitative detection for the analytes were carried out under the multiple reaction monitoring （MRM） in positive ion mode after the chromatographic separation on Symmetry C18 （150 mm×2.1 mm i.d.， 3.5

SymbolmA@ m） column. Studies at fortification level of 0.05－25

SymbolmA@ g/kg gave mean recoveries from 77.6%－92.8% for flumorph， with relative standard deviation （R.S.D.） ≤8.6%. The limit of quantification （LOQ， S/N＝10） was 0.05

SymbolmA@ g/kg. The proposed method was successfully applied to real samples from different kinds of vegetables and fruits. Flumorph residues were detected in 70% of the samples analyzed and the highest concentration level was 1.83

SymbolmA@ g/kg in tomato sample.

Keywords Liquid chromatographytandem mass spectrometry; Conversion; Flumorph; Vegetables； Fruits

（Received 10 May 2011; accepted 6 September 2011）