食品中46種禁限用合成色素的分級提取凈化體系研究

摘 要 建立了46種禁限用合成色素的分級提取凈化體系，采用反相液相色譜多波長檢測對該體系的效果進(jìn)行了評價(jià)。提取凈化體系的第一級采用正己烷振蕩提取、凝膠滲透色譜凈化，實(shí)現(xiàn)了對蘇丹類染料的有效提取分離，回收率均大于80%；第二級采用水振蕩提取，乙腈輔助提取的手段，實(shí)現(xiàn)了對大多數(shù)水溶性合成色素及工業(yè)染料的提取分離，回收率均大于60%；第三級采用甲醇氨水振蕩提取，可實(shí)現(xiàn)對少數(shù)極性較強(qiáng)染料的提取分離，回收率均大于55%。經(jīng)過第二、三級提取后的樣品，無需再凈化，即可直接進(jìn)行高效液相色譜分析，提高了分析效率。采用此體系對樣品進(jìn)行合成色素的測定分析，結(jié)果表明，本方法對含蛋白質(zhì)、脂肪類食品基質(zhì)具有較強(qiáng)的適用性。

關(guān)鍵詞 食品; 合成色素; 分級提取凈化

1 引 言

食品添加劑超量和超種類的濫用是目前食品安全所面對的重大問題之一，合成色素不能為人體提供營養(yǎng)物質(zhì)，甚至?xí)：θ梭w健康。個(gè)別食品加工企業(yè)除了過量添加允許使用的著色劑外，甚至非法向食品中添加有毒性的工業(yè)染料，如蘇丹紅、堿性橙、羅丹明B等。

近年來，對于食品中限用合成色素的檢測方法的研究已經(jīng)很多，禁限用合成色素的儀器分析方法主要為高效液相色譜法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。但由于不同合成色素性質(zhì)差異較大，因此一般分析的目標(biāo)化合物主要集中于某一類物質(zhì)，無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種類組分化合物的分離凈化，造成了前處理方法具有一定的局限性。因此，有必要建立多種類合成色素的提取凈化體系，對食品中可能存在的不同極性、不同種類的合成色素組分進(jìn)行分析。

基于合成色素種類繁多、性質(zhì)差別較大的原因，提取凈化體系的建立首先要保證不同極性的合成色素能夠被提取，其次是提取凈化體系對較多數(shù)的食品樣品能夠適用。奶酪樣品中含有脂肪、蛋白質(zhì)、水分等代表性食品基質(zhì)，本研究以奶酪為模型樣品，采用高效液相色譜多波長檢測法，建立了包括46種禁限用合成色素的分級提取凈化體系。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配DAD檢測器；GPC Vario凝膠滲透色譜儀（德國LCTech公司）；Kinetex C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm×2.6

SymbolmA@ m，美國Phenomenex公司）；MJ3000分析天平（日本YMC公司）；SA31振蕩器（日本Yamato公司）；Avanti J26 XPI高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）。

正己烷、乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷、甲醇（色譜純，德國Merck公司），氨水（28%～30%，美國GFS Chemicals公司），乙酸銨（色譜純，美國Sigma公司）。實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水。

蘇丹類染料以及常用合成色素標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，除蘇丹類染料外的其它工業(yè)用染料購自美國GM公司。稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，配制成500 mg/L的儲備液。奶酪樣品購自北京市朝陽區(qū)某超市。

2.2 分級提取凈化體系操作

由于46種禁限用合成色素種類不同，性質(zhì)差異較大，而奶酪基質(zhì)樣品中脂肪和蛋白質(zhì)含量較高，因此根據(jù)提取溶劑的pKa值及極性大小，選取正己烷乙腈水1%氨水作為樣品前處理的提取溶劑。樣品分級提取凈化步驟如下: （1）稱取2.0 g樣品，加入5 mL水和15 mL正己烷，振蕩20 min，以8000 r/min低溫離心，得到正己烷層、水層以及殘?jiān)唬?）將正己烷層提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1， V/V）定容至10 mL，經(jīng)過凝膠滲透色譜（GPC）凈化得到收集液，將收集液濃縮，用乙腈定容至1 mL，過0.45

SymbolmA@ m濾膜，待分析。（3）水層加入20 mL乙腈，振蕩10 min，以8000 r/min低溫離心，得到25 mL乙腈水層提取液，將提取液過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用甲醇定容至5 mL，過0.45

SymbolmA@ m濾膜，待分析；（4）剩余的殘?jiān)尤?5 mL 1%氨水溶液，振蕩10 min，以8000 r/min低溫離心后取上清液，得到氨水甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1～2 mL，甲醇定容至5 mL，過0.45

SymbolmA@ m濾膜，待分析。

2.3 GPC凈化條件

GPC凈化柱采用德國S19標(biāo)準(zhǔn)柱（400 mm× 25 mm）。填料：BioBeads SX3 200～400 目；流動相：乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1， V/V）。流速：5 mL/min；進(jìn)樣量：5 mL；收集時(shí)間：24～36 min。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取劑的選擇

第一級提取劑采用弱極性的正己烷，有利于提取蘇丹類染料這類脂溶性化合物，同時(shí)將脂肪從樣品中提取出來，以避免對下一級的凈化產(chǎn)生干擾；第二級采用水作為提取劑，可提取水溶性合成色素，通過加入4倍體積乙腈，沉淀樣品水提液中的蛋白質(zhì)組分，同時(shí)防止極性相對偏弱的合成色素隨蛋白質(zhì)沉淀而損失；第三級提取劑采用甲醇氨水溶液，可提取強(qiáng)極性的合成色素及工業(yè)染料等化合物。

3.2 提取劑的添加量對合成色素回收率的影響?yīng)?/p>

在分級提取過程中，乙腈作為水的輔助提取劑，其加入量為水的體積4倍。考察了正己烷水氨水甲醇溶液的加入量對提取率的影響。向樣品中分分別添加有代表性的合成色素蘇丹紅1、誘惑紅和羅丹明B，通過加入不同體積的提取劑，考察正己烷添加體積對蘇丹紅1，水添加體積對誘惑紅，氨水甲醇的濃度和體積對羅丹明B的回收率影響。由圖1可見，正己烷體積大于10 mL時(shí)，提取率趨于穩(wěn)定，考慮到樣品中脂肪成分的提取，確定正己烷體積為15 mL；水體積大于5 mL后，誘惑紅的回收率平穩(wěn)地保持在90%以上，確定水的體積為5 mL；氨水對羅丹明B的回收率影響影響不大，確定氨水濃度為1%（圖2）。

3.3 凈化條件的選擇

第一級正己烷樣品提取溶液中含有較多的脂肪成分，采用凝膠滲透色譜可將其有效去除。如圖3為加標(biāo)樣品正己烷提取溶液的凝膠滲透色譜紫外掃描圖，脂肪大分子在10～16 min出峰，分析物在26～34 min出峰。因此，本研究將收集時(shí)間確定為24～36 min。

圖3 樣品GPC凈化過程紫外掃描色譜圖，插圖為GPC在24～26 min收集組分的液相色譜圖

Fig．3 UV chromatogram of GPC， inset is the chromatogram of fractions between

24 min and 36 min in GPC process

1. Sudan orange G; 2. Sudan Yellow; 3. Sudan red G; 4. Sudan Ⅰ; 5. Sudan Ⅱ; 6. Sudan Ⅲ; 7. Sudan red 7B; 8. Sudan Ⅳ.

第二和第三級未采用聚酰胺吸附法，原因在于經(jīng)過正己烷和水振蕩分配以及乙腈沉淀蛋白質(zhì)后，樣品的二級、三級提取液可直接過濾后無需進(jìn)一步凈化，即可上樣分析，從而簡化了采用聚酰胺吸附法較為繁瑣的處理過程。對于奶酪這種典型性樣品的系統(tǒng)提取凈化處理流程如圖解1所示。

圖解1 奶酪樣品中合成色素分級提取凈化體系

Scheme 1 System of extraction and cleaning of synthetic pigments in cheese samples

3.4 液相色譜條件的優(yōu)化

46種禁限用合成色素種類和性質(zhì)差別較大，為防止在混和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣時(shí)不同性質(zhì)化合物發(fā)生相互反應(yīng)，根據(jù)各物質(zhì)的性質(zhì)將其分為4組：第一組為8種蘇丹類染料化合物；第二組為18種常用的水溶性合成色素，包括國家允許使用及禁止使用；第三組為12種酸性染料化合物，一般作為工業(yè)染料使用；第4組為8種其它工業(yè)染料。

液相色譜DAD檢測器采用多波長檢測，可以有效避免雜質(zhì)組分的干擾。第一組化合物為脂溶性蘇丹類染料，屬于極型偏弱的化合物，因此選擇流動相為乙腈水；第二組、第三組和第四組化合物的極性偏強(qiáng)，在弱酸性條件下色譜分離較好，因此選擇流動相為甲醇20 mmol/L乙酸銨（pH＝4.5）。結(jié)合各化合物的最大吸收波長，確定各組化合物的檢測波長分別為：第一組410和507 nm；第二組 410，507和625 nm，第三組420，520，580和610 nm；第四組410，490，510和614 nm。

表1～表4分別列出了4組共46種合成色素及染料化合物的液相色譜保留時(shí)間以及相應(yīng)的可見光區(qū)最大吸收波長。在各組相對應(yīng)的液相色譜條件下，得到4組化合物的液相色譜圖（圖4～圖7，圖中色譜峰編號分別對應(yīng)表1～表4中每組化合物的編號）。各組化合物分離效果良好，且由于采用了可見光多波長檢測，降低了基質(zhì)的干擾。

3.5 加標(biāo)回收結(jié)果分析

樣品進(jìn)行46種禁限用合成色素及染料化合物加標(biāo)（蘇丹類添加水平為0.1 mg/L，其它化合物添加水平為2.0 mg/L），經(jīng)過系統(tǒng)提取凈化后進(jìn)行液相色譜分析，經(jīng)外標(biāo)法定量計(jì)算分別得到第一、二、三級提取凈化路線的回收率，根據(jù)3倍信噪比（S/N＝3）計(jì)算各合成色素及染料化合物的檢出限等（表5）。

由表5可見，蘇丹類染料屬于脂溶性合成色素，因此只存在于第一級提取體系中；其它38種水溶性合成色素和染料不被正己烷提取，因此大多數(shù)存在于第二級提取體系中（25種），較少數(shù)（6種）在第二、三級提取中均有分布，說明其極性較強(qiáng)；還有少數(shù)（7種）合成色素及染料則存在于更強(qiáng)極性的第三級提取體系中。 46種化合物的回收率均大于60%，說明此分級提取凈化平臺基本適用于46種禁限用合成色素及染料化合物分析。由于46種化合物在合成色素及染料化合物中具有一定的代表性，因此，本方法對于食品中未知合成色素的篩查具有一定的參考價(jià)值。

采用分級提取凈化體系反相高效液相色潽法對市場上5種奶酪產(chǎn)品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，樣品中均未檢出添加合成色素。

3.6 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以奶酪作為分析對象，經(jīng)過三種不同溶劑體系（正己烷乙腈水甲醇氨水）提取凈化處理，以液相色譜DAD檢測器作為分析手段，建立了46種人工合成色素及非法違禁添加合成色素或染料的分析平臺。此分級提取凈化平臺的特點(diǎn)是：能夠有效地對不同極性范圍的多種合成色素及染料化合物進(jìn)行分級提取，利用DAD檢測器的可見波長對合成色素及染料化合物進(jìn)行分析，可以有效避免其它雜質(zhì)組分對樣品中著色組分的干擾。 



References

1 Chen Q C， Mou S F， Houa X P， Riviellob J M， Nia Z M. J. Chromatogr. A， 1998， 827（1）: 73～81

2 GB 2760 2007 Hygienic Standards for Uses of Food Additives. National Standards of the People′s Republic of China

食品添加劑衛(wèi)生使用標(biāo)準(zhǔn)． 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

3 GB/T 5009.35 2003 Determination of Synthetic Colour in Foods. National Standards of the People′s Republic of China

食品中合成著色劑的測定． 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

4 Minioti K S， Sakellariou C F， Thomaidisn S. Anal. Chim. Acta， 2007， 583（01）: 103～104

5 Wang X， Song G X， Wu W P， Zhao J F， Hu Y M. Chromatographia， 2008， 68 （78）: 659～662

6 Vachirapatama N， Mahajaroensiri J， Visessanguan W. Journal of Food and Drug Analysis， 2008， 16（5）: 77～82

7 Yoshioka N， Ichihashi K. Talanta， 2008， 74（5）: 1408～1413

8 MA Qiang， BAI Hua， WANG Chao， ZHANG Qing， MA Wei， ZHOU Xin， DONG YiYang， WANG BaoLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（1）: 51～56

馬 強(qiáng)， 白 樺， 王 超， 張 慶， 馬 微， 周 新， 董益陽， 王寶麟. 分析化學(xué)， 2010， 38（1）: 51～56

9 LIU Min， LI XiaoLin， BIE Wei， WANG MingLin， FENG Qian. Chinese Journal of Chromatography， 2011， 29（2）: 162～167

劉 敏， 李小林， 別 瑋， 王明林， 馮 騫. 色譜， 2011， 29（2）: 162～167

10 ZHAO Shan， ZHANG Jing， YANG Yi， SHAO Bing. Chinese Journal of Chromatography， 2010， 28（4）: 356～362

趙 珊， 張 晶， 楊 奕， 邵 兵. 色譜， 2010， 28（4）: 356～362

A Study on System of Sequential Extraction and Cleaning of 46 Forbidden

and Limited Synthetic Pigments in Food Stuff



ZHAO YanSheng1，2， DONG Ying*1， ZHANG Feng2， YANG MinLi2， FENG Feng2， CHU XiaoGang*2

1（School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013）

2（In Stitute of Food Safety， Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123）



Abstract A system of sequential extraction and cleaning coupled with high performance liquid chromatography （HPLC） by multiwavelength detection applied to the analysis of 46 synthetic pigments and dyes in food was established. The system of sequential extraction was composed of three grades. In the first grade of extraction， the Sudan dyes were extracted with nhexane and cleaned effectively by gel permeation chromatography. The recoveries of 8 Sudan dyes were not less than 80%. In the second grade of extraction， most of watersoluble synthetic pigments were extracted with water assisted by acetonitrile. And the recoveries were not less than 60%. In the third grade of extraction， a few of compounds were extracted using methanol and ammonia water whose concentration was 1.0%. And the recoveries were not less than 55%. It was unnecessary to clean up the extract after the second and third grade of extraction. The detection results of samples from markets showed that the system of sequential extraction and cleaning was suitable for the food stuffs contained protein and fat.

Keywords Food; Synthetic pigment; System of sequential extraction and cleaning

（Received 7 May 2011; accepted 16 September 2011）