用于高效液相色譜測定乳制品中三聚氰胺的流動注射在線固相萃取富集系統

摘 要 國標法測定乳制品中三聚氰胺含量時，其樣品前處理為手工操作，每小時僅能處理1～2個樣品。 因此，本研究基于流動注射分析技術，將國標法的手工操作變成自動過程，建立了一種可與國標法聯用的奶樣全自動固相萃取富集系統，每小時可處理至少10個樣品，實現了奶樣的自動快速處理，并已成功用于三聚氰胺標液及乳制品樣的測定。本方法的特點是環境污染小、操作簡便、自動化程度高，可作為國標法的補充方法。本方法的線性范圍為0.2～50 mg/L （r＝0.9993），相對標準偏差小于3.9%，檢出限為0.1 mg/L，回收率為95.4%～108.0%。

關鍵詞 三聚氰胺； 固相萃取； 流動注射； 高效液相色譜； 乳制品

1 引 言



三聚氰胺（Melamine， ML）是一種白色的氮雜環有機化合物，常用于生產塑料、膠水和阻燃劑等\\。由于ML含氮量高（66.7%），且目前檢測乳制品中蛋白質方法的凱氏定氮法\\無法區分蛋白氮和非蛋白氮，因此ML被不法商人添進乳制品中， 以提高“表觀蛋白質”含量。ML進入人體后可水解產生三聚氰酸，并與三聚氰酸結合成溶解度低的網狀結構氰酸化物，引起泌尿系統結石，危害健康\\，2007年發生在美國的“寵物食品事件”\\，2008年發生在中國的“三聚氰胺牛奶事件”\\就是因為食品中添加了ML造成的。因此，食品中ML含量的檢測具有重要意義。

目前，乳制品中ML的測定方法主要有高效液相色譜法\\、液相色譜質譜法\\、氣相色譜質譜法\\、紅外光譜法\\、毛細管電泳法\\、核磁共振光譜法\\、化學發光法\\等。2008年，我國頒布了原料乳、乳制品以及含乳制品中ML的測定方法\\，包括了前3種方法。但是，限制這些方法分析速度的關鍵是樣品的前處理過程。目前常用的前處理技術有陽離子交換固相萃取\\、分子印跡高聚物固相萃取\\以及固相微萃取\\等; 這些技術均由手工操作，其過程較復雜，無法適用于批量奶樣的快速篩查和分析的要求。因此，開發一種簡便、快速、準確的預處理乳制品中ML的自動化系統很有必要。

流動注射分析（Flow injection analysis， FIA）\\具有分析速度快，試劑耗量少，重現性好等優點。因此，本研究基于FIA，建立了一種的自動固相萃取富集系統（Automatic solid phase extraction enrichment system， ASPEES），實現了乳制品中ML的富集、清洗、洗脫、測定過程的連續自動化。

2 實驗過程

2.1 儀器與試劑

FIA3110型流動注射儀（北京吉天公司）；高效液相色譜儀，UVIDEC100VI型紫外分光光度計（日本分光公司）；AUW型電子天平（日本島津公司），800I型離心機（慧智儀城科技公司）；固相萃取柱（40 mm×3 mm，60 mg，自制）；混合型磺酸陽離子交換樹脂（PCX，40

SymbolmA@ m）、聚乙烯濾片（20

SymbolmA@ m， 北京艾杰爾公司）。

ML（C3H6N6）標準品（上海安譜科學儀器）；庚烷磺酸鈉、乙腈（色譜純）；檸檬酸、冰乙酸、甲醇、乙醇、氨水（分析純，科龍化學公司）；水為超純水（0.65 ms/cm）。

2.2 固相萃取富集柱的制備

將60.0 mg PCX填料裝入柱內（40 mm×3 mm），柱兩端裝上聚乙烯濾片，采用氨化乙醇進行再生處理。

2.3 樣品除蛋白

稱取5.00 g牛奶樣品，置于50 mL容量瓶中，加入1.0 mL冰乙酸（3%， V/V），混勻后分別均勻移至4個15 mL離心管中，以 4000 r/min離心分離10 min，上清液經冰乙酸潤濕的濾紙過濾，即得待凈化液。

2.4 ASPEESHPLC系統及測定過程

ASPEESHPLC系統見圖1a。它由蠕動泵A、蠕動泵B、切換閥、萃取柱、色譜柱、流通式紫外可見分光光度計和數據采集器組成。其動作程序是：第1步，樣品富集，泵B停止，泵A轉動，切換閥處于位置Ⅰ。乳樣在泵A推動下進入萃取柱，乳樣中的ML與萃取柱中的陽離子交換基團發生離子交換，未交換的物質流出萃取柱至排廢W2；第2步，清洗萃取柱，泵B轉動，泵A停止，切換閥仍處于位置Ⅰ。清洗液在泵B的推動下進入萃取柱，將其中未交換的殘留水溶性或脂溶性雜質洗出至W2；第3步，ML洗脫及萃取柱再生，泵B轉動，泵A停止，切換閥切換至位置Ⅱ。洗脫液在泵B的推動下進入萃取柱，洗脫液中的NH＋4與萃取柱內填料上的ML進行離子交換，使填料再生的同時將ML洗脫下來，并以“濃縮樣品塞”的形式隨洗脫液從萃取柱流出，直接進入采樣閥的采樣定量環（60

SymbolmA@ L），對預處理后的樣品進行體積定量，并排廢至W2；然后，系統再自動跳入第1步程序，開始下一個樣品的前處理。

在此過程中，泵C連續轉動，采樣閥處于采樣位置，流動相在泵C的推動下經采樣閥依次進入色譜柱和流通式檢測器（237 nm），給出一個穩定的基線；當從萃取柱流出的“濃縮樣品塞”正好處于定量環內時，采樣閥切換至注入位置，流動相將注入的“樣品塞”推進色譜柱和流通式檢測器，實測信號由數據采集器記錄和處理。乳制品的實測曲線見圖1b。

3 結果與討論

3.1 實驗條件的優化

3.1.1 清洗液中甲醇和乙醇含量的影響 國標法\\采用甲醇清洗萃取柱。本實驗考察了甲醇和乙醇清洗液的影響。ASPEES系統設定的初始條件是：ML標液用量6 mL，流速1.2 mL/min；清洗液流速1.0 mL/min，7.0% （V/V）氨化甲醇為洗脫液，其流速1.48 mL/min；清洗和洗脫時間見圖1。實驗結果見圖2a。隨著清洗液中甲醇或乙醇含量增大，ML的響應信號均下降，當含量大于60%時，吸光度降至最低；甲醇清洗液下降趨勢大于乙醇；對于5.0 mg/L ML，當清洗液中甲醇或乙醇含量達到60%時，吸光度趨于零。這是因為ML與萃取柱存在離子交換和溶解平衡，由于ML在甲醇或乙醇中的溶解度遠大于水，所以導致被離子交換而富集在萃取柱上的ML又被溶解下來，導致吸光度降低。此外，由于ML在甲醇中的溶解度大于乙醇，因此甲醇清洗液的下降趨勢大于乙醇。

在此基礎上，在牛奶樣品中添加不同濃度的ML標液，繼續考察了清洗液中甲醇或乙醇含量對ML富集的影響，其結果見圖2b。可以看出，牛奶樣品中ML吸光度的變化趨勢與其標液相同（圖2a）。因此，最終選定清洗液為超純水。由此也發現，國標方法\\用甲醇清洗萃取柱是不合理的。

3.1.2 樣品中甲醇和乙醇以及冰乙酸濃度的影響

上述實驗表明，甲醇或乙醇的存在將影響ML富集和測定。在ML標樣 （5和10 mg/L） 中添加了不同濃度的甲醇或乙醇，進一步考察了其含量的影響。結果表明，ML標樣中甲醇或乙醇含量增大，均導致ML吸光度減弱，變化趨勢同圖2a，其原因也與3.1.1節相同。此外，由于在測定乳制品時需先用冰乙酸沉淀蛋白質，上清液作為ASPEES系統的樣品，考察了冰乙酸濃度的影響。結果表明，用0～0.15%冰乙酸沉淀牛奶樣品中的蛋白質，不影響ML測定。

3.1.3 上樣流速及用量的影響

萃取柱填料的離子交換速度取決于離子擴散速度，而填料表面離子交換層的液膜擴散速度又與含ML樣品流速相關。因此，固定上樣體積（8.0 mL），用5和20 mg/L的ML標樣作為樣品，考察了上樣流速（F）的影響。圖3a表明，上樣流速為1.2 mL/min時，吸光度值最大。上樣流速增大，萃取柱填料表面水膜變薄，離子表面擴散速率得以提高，

導致ML與交換基團上的NH＋4交換迅速，其富集量增大，吸光度增大；當上樣流速太高時，可能由于ML來不及與填料表面的NH＋4交換就被排出，導致其富集量降低，響應信號降低。因此，本研究選定樣品的流速為1.2 mL/min。

在此流速下，考察了樣品用量對吸光度的影響。圖3b表明，樣品用量增加，響應信號逐漸增大。當樣品用量達到12 mL時，響應信號不再變化。其原因是，上樣流速一定時，樣品用量增加，會使更多的ML與填料表面的NH＋4發生接觸和離子交換，導致其富集量增多，響應信號增大；當樣品用量為12 mL時，填料離子交換容量達到飽和，ML富集量不再增多，響應信號不再變化。

3.1.4 清洗液用量及流速的影響 以5和20 mg/L的ML標液作為樣品，在0.75～4.50 mL的范圍內，考察了清洗液用量的影響。實驗表明，清洗液用量增大，響應信號迅速下降，在2.5 mL時響應信號不再變化。這是因為，清洗液用量逐漸增大，柱中未交換的ML殘液被逐漸洗出；清洗液用量達到 2.5 mL時，未交換的ML被全部洗出，柱中僅留下交換在填料表面上的ML，響應信號不再變化。最終清洗液用量選定為2.5 mL。

在此基礎上考察了清洗液流速的影響。結果表明，在0.54～1.05 mL/min范圍內，吸光度變化程度不大；當清洗液流速大于1.05 mL/min時，響應信號隨流速增大而開始逐漸減小，其原因可能是使部分吸附在柱上的ML受到液流的剪切作用也被洗脫下來，導致ML流失，響應信號降低。綜合考慮分析速度及靈敏度，最終清洗液流速選定為1.0 mL/min。

3.1.5 洗脫液流速及時間的影響 將柱內“濃縮樣品塞”洗脫開始至流入采樣環內所用的時間定義為洗脫時間，在連接管長度（50 cm）及內徑不變的前提下，洗脫液流速變化，洗脫時間就會相應變化。因此，用20 mg/L的ML標液作為樣品，在0.85～2.0 mL/min的范圍內考察了洗脫時間對吸光度的影響。結果表明，洗脫時間隨洗脫液流速增大而減小；流速增大，響應信號先增大后減小；當洗脫液流速為1.5 mL/min時，響應信號最大；由于洗脫液流速增大會使萃取柱中填料表面水膜變薄，填料表面吸附的ML更容易被洗脫液中的NH＋4交換下來， 進入洗脫液，使洗脫液中ML量增大，響應信號隨之增大；當洗脫液流速大于1.5 mL/min時，流量過快，導致洗脫液中的NH＋4來不及與更多的ML進行交換反應，使洗脫液中ML量減少，響應信號隨之降低。因此，洗脫液流速選定為1.50 mL/min，此時洗脫時間為30 s。

3.1.6 洗脫液溶劑及NH＋4濃度的考察 用NH＋4可將柱內填料上吸附的ML置換下來，同時使填料交換基團得到再生\\。本實驗用5和20 mg/L的ML標準溶液作為測試樣品，洗脫液中NH＋4濃度固定在7.0% （V/V），分別考察了不同溶劑中NH＋4對ML的洗脫效果。結果表明，氨化甲醇洗脫的ML最多，氨化乙醇洗脫的ML量略低于甲醇，單純氨水作為洗脫液洗脫的ML最少。其原因是，甲醇和乙醇對ML的溶解度大，被NH＋4交換下來的ML很快溶解在洗脫液中，使離子交換反應利于ML洗脫。此外，由于ML在甲醇中的溶解度略大于乙醇，因此甲醇洗脫液洗脫的ML較多。但考慮到甲醇毒性大，最終選擇氨化乙醇作為洗脫液。

實驗表明，增大氨化乙醇中NH＋4濃度，被洗脫下來的ML量增多，方法的靈敏度增大；當NH＋4達到12%時，響應信號不再增加。考慮靈敏度和環保，最終選定乙醇洗脫液中NH＋4濃度為12.0% （V/V）。

3.1.7 色譜柱相關條件的選擇 C18和C8兩種填料色譜柱都可用于ML的測定\\。為提高分析速度，對相同尺寸的C18與C8柱（150 cm × 4.6 mm， 5

SymbolmA@ m）的分離效果進行了考察。流動相的組成為10 mmol/L庚烷磺酸鈉＋15% （V/V）乙腈（pH 2.5），其流量為0.8 mL/min；進樣體積為20

SymbolmA@ L\\；ML標準溶液（cML）作為樣品。結果表明，由C8柱（ＡC8＝0.0032cML＋0.001， r＝0.9998）和C18柱（ＡC18 ＝0.0028cML＋0.001， r＝0.9991）得到的標準曲線線性均很好，但C8柱的保留時間短（5.53 min）、靈敏度高，因此選用了C8柱。考察了C8柱長對tR及靈敏度的影響。結果表明，由150 cm （Ａ150＝0.0032cML＋0.001， r＝0.9999）和250 cm （Ａ250＝0.0019cML＋0.001， r＝0.9999）色譜柱得到的ML線性響應都很好，但150 cm色譜柱的靈敏度高，且保留時間tR150（5.53 min） ＜tR250（9.05 min）。因此，本系統選用了150 cm的C8柱。

3.2 標準曲線及重現性測定 在上述選定的條件下，采用1.0和10 mg/L的ML標準溶液對ASPEESHPLC系統進行了的重現性（n＝11）和線性實驗。結果表明：ASPEESHPLC系統精密度很好（A: 0.00463±0.00018， RSD ≤3.9%， 1.0 mg/L; A: 0.046±0.0012， RSD ≤2.7%， 10 mg/L），而且在0.2～50 mg/L范圍內有很好的線性相關（ΔA＝0.0052cML －0.0031，r＝0.9993）。經計算，本方法的檢出限為0.1 mg/L。



3.3 樣品分析

3.3.1 牛奶樣品分析及回收率 為了考察本系統的可靠性，在最佳測定條件下，在4種乳制品（純牛奶、乳飲料、酸奶、奶粉）中添加2.0 mg/L ML作為樣品，進行了回收率實驗。結果表明，回收率在95.4%～108%之間，令人滿意；這也證明乳制品的基體對本方法不干擾。

3.3.2 對比實驗 為進一步考察本方法的可靠性，采用國標方法\\和標準加入法對同樣的奶樣進行測定，結果見表1。可以看出，3種方法的測定結果一致，表明本方法可用于乳制品中ML含量的測定。

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A FlowInjection Online Solid Phase Extraction， Enrichment System

for Determination of Melamine in Milk Products Based on

High Performance Liquid Chromatography

LI YongSheng*， LIANG QinQin， HOU YanQiu and LI HongXing



（School of Chemical Engineering， Sichuan University， 610065 Chengdu）



Abstract In current， for the determination of melamine content in milk products by high performance liquid chromatography （HPLC） in GB （Chinese standard）， the sample pretreatment is all manual operation， and its pretreatment speed is only 1－2 samples per hour. Therefore， a new automatic solid phase extraction enrichment system （ASPEES） based on the flowinjection analysis was established. The system′s pretreatment speed had attained 10 samples per hour. The method has the advantages of rapid， small pollution and high automation. Linear range of the method was in the range of 0.2－50 mg/L （r＝0.9993）， relative standard deviation was less than 3.9%， detection limit was 0.1 mg/L， recovery was 95.4%－108.1%. It can be used as a new complement for the GB method.

Keywords Melamine; Automatic solidphase extraction; Flowinjection; Highperformance liquid chromatography; Milk products

（Received 29 June 2011; accepted 21 September 2011）