用于高效液相色譜測定乳制品中三聚氰胺的流動(dòng)注射在線固相萃取富集系統(tǒng)

摘 要 國標(biāo)法測定乳制品中三聚氰胺含量時(shí)，其樣品前處理為手工操作，每小時(shí)僅能處理1～2個(gè)樣品。 因此，本研究基于流動(dòng)注射分析技術(shù)，將國標(biāo)法的手工操作變成自動(dòng)過程，建立了一種可與國標(biāo)法聯(lián)用的奶樣全自動(dòng)固相萃取富集系統(tǒng)，每小時(shí)可處理至少10個(gè)樣品，實(shí)現(xiàn)了奶樣的自動(dòng)快速處理，并已成功用于三聚氰胺標(biāo)液及乳制品樣的測定。本方法的特點(diǎn)是環(huán)境污染小、操作簡便、自動(dòng)化程度高，可作為國標(biāo)法的補(bǔ)充方法。本方法的線性范圍為0.2～50 mg/L （r＝0.9993），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.9%，檢出限為0.1 mg/L，回收率為95.4%～108.0%。

關(guān)鍵詞 三聚氰胺； 固相萃?。?流動(dòng)注射； 高效液相色譜； 乳制品

1 引 言



三聚氰胺（Melamine， ML）是一種白色的氮雜環(huán)有機(jī)化合物，常用于生產(chǎn)塑料、膠水和阻燃劑等\\。由于ML含氮量高（66.7%），且目前檢測乳制品中蛋白質(zhì)方法的凱氏定氮法\\無法區(qū)分蛋白氮和非蛋白氮，因此ML被不法商人添進(jìn)乳制品中， 以提高“表觀蛋白質(zhì)”含量。ML進(jìn)入人體后可水解產(chǎn)生三聚氰酸，并與三聚氰酸結(jié)合成溶解度低的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)氰酸化物，引起泌尿系統(tǒng)結(jié)石，危害健康\\，2007年發(fā)生在美國的“寵物食品事件”\\，2008年發(fā)生在中國的“三聚氰胺牛奶事件”\\就是因?yàn)槭称分刑砑恿薓L造成的。因此，食品中ML含量的檢測具有重要意義。

目前，乳制品中ML的測定方法主要有高效液相色譜法\\、液相色譜質(zhì)譜法\\、氣相色譜質(zhì)譜法\\、紅外光譜法\\、毛細(xì)管電泳法\\、核磁共振光譜法\\、化學(xué)發(fā)光法\\等。2008年，我國頒布了原料乳、乳制品以及含乳制品中ML的測定方法\\，包括了前3種方法。但是，限制這些方法分析速度的關(guān)鍵是樣品的前處理過程。目前常用的前處理技術(shù)有陽離子交換固相萃取\\、分子印跡高聚物固相萃取\\以及固相微萃取\\等; 這些技術(shù)均由手工操作，其過程較復(fù)雜，無法適用于批量奶樣的快速篩查和分析的要求。因此，開發(fā)一種簡便、快速、準(zhǔn)確的預(yù)處理乳制品中ML的自動(dòng)化系統(tǒng)很有必要。

流動(dòng)注射分析（Flow injection analysis， FIA）\\具有分析速度快，試劑耗量少，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究基于FIA，建立了一種的自動(dòng)固相萃取富集系統(tǒng)（Automatic solid phase extraction enrichment system， ASPEES），實(shí)現(xiàn)了乳制品中ML的富集、清洗、洗脫、測定過程的連續(xù)自動(dòng)化。

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1 儀器與試劑

FIA3110型流動(dòng)注射儀（北京吉天公司）；高效液相色譜儀，UVIDEC100VI型紫外分光光度計(jì)（日本分光公司）；AUW型電子天平（日本島津公司），800I型離心機(jī)（慧智儀城科技公司）；固相萃取柱（40 mm×3 mm，60 mg，自制）；混合型磺酸陽離子交換樹脂（PCX，40

SymbolmA@ m）、聚乙烯濾片（20

SymbolmA@ m， 北京艾杰爾公司）。

ML（C3H6N6）標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜科學(xué)儀器）；庚烷磺酸鈉、乙腈（色譜純）；檸檬酸、冰乙酸、甲醇、乙醇、氨水（分析純，科龍化學(xué)公司）；水為超純水（0.65 ms/cm）。

2.2 固相萃取富集柱的制備

將60.0 mg PCX填料裝入柱內(nèi)（40 mm×3 mm），柱兩端裝上聚乙烯濾片，采用氨化乙醇進(jìn)行再生處理。

2.3 樣品除蛋白

稱取5.00 g牛奶樣品，置于50 mL容量瓶中，加入1.0 mL冰乙酸（3%， V/V），混勻后分別均勻移至4個(gè)15 mL離心管中，以 4000 r/min離心分離10 min，上清液經(jīng)冰乙酸潤濕的濾紙過濾，即得待凈化液。

2.4 ASPEESHPLC系統(tǒng)及測定過程

ASPEESHPLC系統(tǒng)見圖1a。它由蠕動(dòng)泵A、蠕動(dòng)泵B、切換閥、萃取柱、色譜柱、流通式紫外可見分光光度計(jì)和數(shù)據(jù)采集器組成。其動(dòng)作程序是：第1步，樣品富集，泵B停止，泵A轉(zhuǎn)動(dòng)，切換閥處于位置Ⅰ。乳樣在泵A推動(dòng)下進(jìn)入萃取柱，乳樣中的ML與萃取柱中的陽離子交換基團(tuán)發(fā)生離子交換，未交換的物質(zhì)流出萃取柱至排廢W2；第2步，清洗萃取柱，泵B轉(zhuǎn)動(dòng)，泵A停止，切換閥仍處于位置Ⅰ。清洗液在泵B的推動(dòng)下進(jìn)入萃取柱，將其中未交換的殘留水溶性或脂溶性雜質(zhì)洗出至W2；第3步，ML洗脫及萃取柱再生，泵B轉(zhuǎn)動(dòng)，泵A停止，切換閥切換至位置Ⅱ。洗脫液在泵B的推動(dòng)下進(jìn)入萃取柱，洗脫液中的NH＋4與萃取柱內(nèi)填料上的ML進(jìn)行離子交換，使填料再生的同時(shí)將ML洗脫下來，并以“濃縮樣品塞”的形式隨洗脫液從萃取柱流出，直接進(jìn)入采樣閥的采樣定量環(huán)（60

SymbolmA@ L），對預(yù)處理后的樣品進(jìn)行體積定量，并排廢至W2；然后，系統(tǒng)再自動(dòng)跳入第1步程序，開始下一個(gè)樣品的前處理。

在此過程中，泵C連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)，采樣閥處于采樣位置，流動(dòng)相在泵C的推動(dòng)下經(jīng)采樣閥依次進(jìn)入色譜柱和流通式檢測器（237 nm），給出一個(gè)穩(wěn)定的基線；當(dāng)從萃取柱流出的“濃縮樣品塞”正好處于定量環(huán)內(nèi)時(shí)，采樣閥切換至注入位置，流動(dòng)相將注入的“樣品塞”推進(jìn)色譜柱和流通式檢測器，實(shí)測信號由數(shù)據(jù)采集器記錄和處理。乳制品的實(shí)測曲線見圖1b。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.1.1 清洗液中甲醇和乙醇含量的影響 國標(biāo)法\\采用甲醇清洗萃取柱。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙醇清洗液的影響。ASPEES系統(tǒng)設(shè)定的初始條件是：ML標(biāo)液用量6 mL，流速1.2 mL/min；清洗液流速1.0 mL/min，7.0% （V/V）氨化甲醇為洗脫液，其流速1.48 mL/min；清洗和洗脫時(shí)間見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2a。隨著清洗液中甲醇或乙醇含量增大，ML的響應(yīng)信號均下降，當(dāng)含量大于60%時(shí)，吸光度降至最低；甲醇清洗液下降趨勢大于乙醇；對于5.0 mg/L ML，當(dāng)清洗液中甲醇或乙醇含量達(dá)到60%時(shí)，吸光度趨于零。這是因?yàn)镸L與萃取柱存在離子交換和溶解平衡，由于ML在甲醇或乙醇中的溶解度遠(yuǎn)大于水，所以導(dǎo)致被離子交換而富集在萃取柱上的ML又被溶解下來，導(dǎo)致吸光度降低。此外，由于ML在甲醇中的溶解度大于乙醇，因此甲醇清洗液的下降趨勢大于乙醇。

在此基礎(chǔ)上，在牛奶樣品中添加不同濃度的ML標(biāo)液，繼續(xù)考察了清洗液中甲醇或乙醇含量對ML富集的影響，其結(jié)果見圖2b?？梢钥闯觯Ｄ虡悠分蠱L吸光度的變化趨勢與其標(biāo)液相同（圖2a）。因此，最終選定清洗液為超純水。由此也發(fā)現(xiàn)，國標(biāo)方法\\用甲醇清洗萃取柱是不合理的。

3.1.2 樣品中甲醇和乙醇以及冰乙酸濃度的影響

上述實(shí)驗(yàn)表明，甲醇或乙醇的存在將影響ML富集和測定。在ML標(biāo)樣 （5和10 mg/L） 中添加了不同濃度的甲醇或乙醇，進(jìn)一步考察了其含量的影響。結(jié)果表明，ML標(biāo)樣中甲醇或乙醇含量增大，均導(dǎo)致ML吸光度減弱，變化趨勢同圖2a，其原因也與3.1.1節(jié)相同。此外，由于在測定乳制品時(shí)需先用冰乙酸沉淀蛋白質(zhì)，上清液作為ASPEES系統(tǒng)的樣品，考察了冰乙酸濃度的影響。結(jié)果表明，用0～0.15%冰乙酸沉淀牛奶樣品中的蛋白質(zhì)，不影響ML測定。

3.1.3 上樣流速及用量的影響

萃取柱填料的離子交換速度取決于離子擴(kuò)散速度，而填料表面離子交換層的液膜擴(kuò)散速度又與含ML樣品流速相關(guān)。因此，固定上樣體積（8.0 mL），用5和20 mg/L的ML標(biāo)樣作為樣品，考察了上樣流速（F）的影響。圖3a表明，上樣流速為1.2 mL/min時(shí)，吸光度值最大。上樣流速增大，萃取柱填料表面水膜變薄，離子表面擴(kuò)散速率得以提高，

導(dǎo)致ML與交換基團(tuán)上的NH＋4交換迅速，其富集量增大，吸光度增大；當(dāng)上樣流速太高時(shí)，可能由于ML來不及與填料表面的NH＋4交換就被排出，導(dǎo)致其富集量降低，響應(yīng)信號降低。因此，本研究選定樣品的流速為1.2 mL/min。

在此流速下，考察了樣品用量對吸光度的影響。圖3b表明，樣品用量增加，響應(yīng)信號逐漸增大。當(dāng)樣品用量達(dá)到12 mL時(shí)，響應(yīng)信號不再變化。其原因是，上樣流速一定時(shí)，樣品用量增加，會使更多的ML與填料表面的NH＋4發(fā)生接觸和離子交換，導(dǎo)致其富集量增多，響應(yīng)信號增大；當(dāng)樣品用量為12 mL時(shí)，填料離子交換容量達(dá)到飽和，ML富集量不再增多，響應(yīng)信號不再變化。

3.1.4 清洗液用量及流速的影響 以5和20 mg/L的ML標(biāo)液作為樣品，在0.75～4.50 mL的范圍內(nèi)，考察了清洗液用量的影響。實(shí)驗(yàn)表明，清洗液用量增大，響應(yīng)信號迅速下降，在2.5 mL時(shí)響應(yīng)信號不再變化。這是因?yàn)?，清洗液用量逐漸增大，柱中未交換的ML殘液被逐漸洗出；清洗液用量達(dá)到 2.5 mL時(shí)，未交換的ML被全部洗出，柱中僅留下交換在填料表面上的ML，響應(yīng)信號不再變化。最終清洗液用量選定為2.5 mL。

在此基礎(chǔ)上考察了清洗液流速的影響。結(jié)果表明，在0.54～1.05 mL/min范圍內(nèi)，吸光度變化程度不大；當(dāng)清洗液流速大于1.05 mL/min時(shí)，響應(yīng)信號隨流速增大而開始逐漸減小，其原因可能是使部分吸附在柱上的ML受到液流的剪切作用也被洗脫下來，導(dǎo)致ML流失，響應(yīng)信號降低。綜合考慮分析速度及靈敏度，最終清洗液流速選定為1.0 mL/min。

3.1.5 洗脫液流速及時(shí)間的影響 將柱內(nèi)“濃縮樣品塞”洗脫開始至流入采樣環(huán)內(nèi)所用的時(shí)間定義為洗脫時(shí)間，在連接管長度（50 cm）及內(nèi)徑不變的前提下，洗脫液流速變化，洗脫時(shí)間就會相應(yīng)變化。因此，用20 mg/L的ML標(biāo)液作為樣品，在0.85～2.0 mL/min的范圍內(nèi)考察了洗脫時(shí)間對吸光度的影響。結(jié)果表明，洗脫時(shí)間隨洗脫液流速增大而減小；流速增大，響應(yīng)信號先增大后減??；當(dāng)洗脫液流速為1.5 mL/min時(shí)，響應(yīng)信號最大；由于洗脫液流速增大會使萃取柱中填料表面水膜變薄，填料表面吸附的ML更容易被洗脫液中的NH＋4交換下來， 進(jìn)入洗脫液，使洗脫液中ML量增大，響應(yīng)信號隨之增大；當(dāng)洗脫液流速大于1.5 mL/min時(shí)，流量過快，導(dǎo)致洗脫液中的NH＋4來不及與更多的ML進(jìn)行交換反應(yīng)，使洗脫液中ML量減少，響應(yīng)信號隨之降低。因此，洗脫液流速選定為1.50 mL/min，此時(shí)洗脫時(shí)間為30 s。

3.1.6 洗脫液溶劑及NH＋4濃度的考察 用NH＋4可將柱內(nèi)填料上吸附的ML置換下來，同時(shí)使填料交換基團(tuán)得到再生\\。本實(shí)驗(yàn)用5和20 mg/L的ML標(biāo)準(zhǔn)溶液作為測試樣品，洗脫液中NH＋4濃度固定在7.0% （V/V），分別考察了不同溶劑中NH＋4對ML的洗脫效果。結(jié)果表明，氨化甲醇洗脫的ML最多，氨化乙醇洗脫的ML量略低于甲醇，單純氨水作為洗脫液洗脫的ML最少。其原因是，甲醇和乙醇對ML的溶解度大，被NH＋4交換下來的ML很快溶解在洗脫液中，使離子交換反應(yīng)利于ML洗脫。此外，由于ML在甲醇中的溶解度略大于乙醇，因此甲醇洗脫液洗脫的ML較多。但考慮到甲醇毒性大，最終選擇氨化乙醇作為洗脫液。

實(shí)驗(yàn)表明，增大氨化乙醇中NH＋4濃度，被洗脫下來的ML量增多，方法的靈敏度增大；當(dāng)NH＋4達(dá)到12%時(shí)，響應(yīng)信號不再增加。考慮靈敏度和環(huán)保，最終選定乙醇洗脫液中NH＋4濃度為12.0% （V/V）。

3.1.7 色譜柱相關(guān)條件的選擇 C18和C8兩種填料色譜柱都可用于ML的測定\\。為提高分析速度，對相同尺寸的C18與C8柱（150 cm × 4.6 mm， 5

SymbolmA@ m）的分離效果進(jìn)行了考察。流動(dòng)相的組成為10 mmol/L庚烷磺酸鈉＋15% （V/V）乙腈（pH 2.5），其流量為0.8 mL/min；進(jìn)樣體積為20

SymbolmA@ L\\；ML標(biāo)準(zhǔn)溶液（cML）作為樣品。結(jié)果表明，由C8柱（ＡC8＝0.0032cML＋0.001， r＝0.9998）和C18柱（ＡC18 ＝0.0028cML＋0.001， r＝0.9991）得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性均很好，但C8柱的保留時(shí)間短（5.53 min）、靈敏度高，因此選用了C8柱?？疾炝薈8柱長對tR及靈敏度的影響。結(jié)果表明，由150 cm （Ａ150＝0.0032cML＋0.001， r＝0.9999）和250 cm （Ａ250＝0.0019cML＋0.001， r＝0.9999）色譜柱得到的ML線性響應(yīng)都很好，但150 cm色譜柱的靈敏度高，且保留時(shí)間tR150（5.53 min） ＜tR250（9.05 min）。因此，本系統(tǒng)選用了150 cm的C8柱。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及重現(xiàn)性測定 在上述選定的條件下，采用1.0和10 mg/L的ML標(biāo)準(zhǔn)溶液對ASPEESHPLC系統(tǒng)進(jìn)行了的重現(xiàn)性（n＝11）和線性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：ASPEESHPLC系統(tǒng)精密度很好（A: 0.00463±0.00018， RSD ≤3.9%， 1.0 mg/L; A: 0.046±0.0012， RSD ≤2.7%， 10 mg/L），而且在0.2～50 mg/L范圍內(nèi)有很好的線性相關(guān)（ΔA＝0.0052cML －0.0031，r＝0.9993）。經(jīng)計(jì)算，本方法的檢出限為0.1 mg/L。



3.3 樣品分析

3.3.1 牛奶樣品分析及回收率 為了考察本系統(tǒng)的可靠性，在最佳測定條件下，在4種乳制品（純牛奶、乳飲料、酸奶、奶粉）中添加2.0 mg/L ML作為樣品，進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，回收率在95.4%～108%之間，令人滿意；這也證明乳制品的基體對本方法不干擾。

3.3.2 對比實(shí)驗(yàn) 為進(jìn)一步考察本方法的可靠性，采用國標(biāo)方法\\和標(biāo)準(zhǔn)加入法對同樣的奶樣進(jìn)行測定，結(jié)果見表1?？梢钥闯?，3種方法的測定結(jié)果一致，表明本方法可用于乳制品中ML含量的測定。

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A FlowInjection Online Solid Phase Extraction， Enrichment System

for Determination of Melamine in Milk Products Based on

High Performance Liquid Chromatography

LI YongSheng*， LIANG QinQin， HOU YanQiu and LI HongXing



（School of Chemical Engineering， Sichuan University， 610065 Chengdu）



Abstract In current， for the determination of melamine content in milk products by high performance liquid chromatography （HPLC） in GB （Chinese standard）， the sample pretreatment is all manual operation， and its pretreatment speed is only 1－2 samples per hour. Therefore， a new automatic solid phase extraction enrichment system （ASPEES） based on the flowinjection analysis was established. The system′s pretreatment speed had attained 10 samples per hour. The method has the advantages of rapid， small pollution and high automation. Linear range of the method was in the range of 0.2－50 mg/L （r＝0.9993）， relative standard deviation was less than 3.9%， detection limit was 0.1 mg/L， recovery was 95.4%－108.1%. It can be used as a new complement for the GB method.

Keywords Melamine; Automatic solidphase extraction; Flowinjection; Highperformance liquid chromatography; Milk products

（Received 29 June 2011; accepted 21 September 2011）