單細(xì)胞激光拉曼光譜檢測(cè)重組大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)甲酸脫氫酶

摘 要 甲酸脫氫酶（FDH，EC1.2.1.2）在工業(yè)生產(chǎn)中有重要的應(yīng)用價(jià)值，工業(yè)上應(yīng)用的FDH可以通過(guò)構(gòu)建高水平表達(dá)重組FDH蛋白的基因工程菌生產(chǎn)，用分子生物學(xué)的方法檢測(cè)重組蛋白的高效表達(dá)和積累操作繁雜，耗時(shí)耗力且需要破碎細(xì)胞。為了尋找一種簡(jiǎn)單快速，不需破碎細(xì)胞， 且能實(shí)時(shí)檢測(cè)FDH重組蛋白在基因工程菌中表達(dá)情況的方法，本研究應(yīng)用單細(xì)胞激光拉曼光譜分析技術(shù)（LTRS），研究IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間后甲酸脫氫酶重組蛋白（FDH）在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，F(xiàn)DH的特征峰1004，1355，1455和1667 cm

Symbolm@@ 1隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，說(shuō)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中FDH重組蛋白在重組大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)并積累，這4個(gè)峰強(qiáng)的增加值所反映的FDH表達(dá)量與SDS-PAGE電泳分析結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，LTRS是快速有效檢測(cè)單個(gè)大腸桿菌活細(xì)胞體內(nèi)重組FDH實(shí)時(shí)表達(dá)的一種非入侵方法。

關(guān)鍵詞 大腸桿菌； 甲酸脫氫酶； 重組蛋白表達(dá)； 單細(xì)胞； 拉曼光譜

1 引 言

甲酸脫氫酶（Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH，EC1.2.1.2）是廣泛存在于各種生物體中一種依賴NAD+的重要酶[1]。研究表明，NAD+依賴型FDH在甲基營(yíng)養(yǎng)菌生物合成和能量代謝中起重要作用。甲基營(yíng)養(yǎng)菌能利用和代謝氯化物，氯化物在甲基營(yíng)養(yǎng)菌細(xì)胞中首先被氧化為甲醛，然后進(jìn)入到異化途徑， 經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)， 最終氧化生成CO2，或進(jìn)入同化途徑， 轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞的組成成分。作為甲醛異化代謝的最后一步關(guān)鍵酶，F(xiàn)DH將甲酸氧化為CO2，同時(shí)將NAD+還原成NADH，還原的NADH為這些微生物提供了所需的能量[2]。由于FDH催化的反應(yīng)可以再生NADH，因此在工業(yè)生產(chǎn)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，工業(yè)上應(yīng)用的FDH可以通過(guò)構(gòu)建高水平表達(dá)重組FDH蛋白的基因工程菌來(lái)生產(chǎn)[3，4]。檢測(cè)重組蛋白的高效表達(dá)和積累，一般利用分子生物學(xué)的方法有SDS-PAGE、Western blotting和質(zhì)譜等方法，這些方法操作繁雜，耗時(shí)耗力，樣品需要染色標(biāo)記，甚至破碎細(xì)胞。單細(xì)胞光鑷?yán)庾V技術(shù)（LTRS）的應(yīng)用，使得溶液中單個(gè)活細(xì)胞的生理生化變化過(guò)程的研究成為可能[5]。由于生物大分子，如核酸、蛋白、脂類和糖類等，都具有特異的拉曼光譜。從這些特征的光譜中可以獲取細(xì)胞生物大分子的組成、結(jié)構(gòu)及生理狀態(tài)等重要信息[6，7]。Chan等[8]首次應(yīng)用LTRS研究用異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl thiogalactoside， IPTG）誘導(dǎo)單個(gè)重組大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞重組糖蛋白（Myelin oligodendrocyte glycoprotein， MOG），結(jié)果顯示， 蛋白質(zhì)的拉曼特征峰1257， 1340， 1453， 和1660 cm

Symbolm@@ 1的峰強(qiáng)隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這種變化主要是IPTG誘導(dǎo)MOG的過(guò)量表達(dá)所致。Xie等[9]利用單細(xì)胞激光拉曼光譜（LTRS）成功快速地檢測(cè)出斑馬魚(yú)β生長(zhǎng)乳素重組蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)LTRS發(fā)現(xiàn)活體單細(xì)胞內(nèi)重組蛋白的表達(dá)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增多，且在細(xì)胞內(nèi)累積，并對(duì)該重組蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。與傳統(tǒng)的SDS-PAGE相比，LTRS單細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)重組細(xì)菌重組蛋白的表達(dá)，不需要破碎細(xì)胞，也不需要染色標(biāo)記，樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)單，樣品需要量少，可以在單細(xì)胞水平上研究活體細(xì)胞重組蛋白的表達(dá)，具有非破壞性和檢測(cè)速度快的特點(diǎn)。本研究利用已經(jīng)構(gòu)建好重組質(zhì)粒pET28a-fdh轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli Rosetta，應(yīng)用LTRS研究 IPTG誘導(dǎo)單個(gè)大腸桿菌活體細(xì)胞中重組蛋白FDH的實(shí)時(shí)表達(dá)，為分析基因工程菌中FDH的表達(dá)提供一種簡(jiǎn)單快速，且不需要破壞細(xì)菌細(xì)胞的方法。2 實(shí)驗(yàn)部分