蝦肉中呋喃它酮代謝物化學發光酶免疫分析方法的建立

1 引 言

呋喃它酮是一種人工合成的硝基呋喃類抗生素，主要用于畜禽和水產動物的各種腸道感染性疾病的治療及促進生長的添加劑，曾經在畜禽水產養殖中廣泛應用。有關研究證明，呋喃它酮及其代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ）具有相當大的毒性和副作用，能誘導有機體基因突變及致畸胎，且能誘發癌癥[1，2]。美國、加拿大、中國和歐盟的很多國家都已規定動物源性食品中呋喃它酮及其代謝物AMOZ殘留為不得檢出。但是因為其價格低廉、療效好，目前違法使用現象在很多國家仍然存在，故有必要對動物源性食品中呋喃它酮及其代謝物AMOZ加強監控[3]。由于呋喃它酮原藥不穩定， 進入動物體內后會被迅速代謝和分解，對原藥的檢測難度很大，但其代謝物AMOZ可以蛋白結合物的形式長期、穩定存在組織內，在適當的酸性條件下，這些結合殘留物可以從蛋白質中釋放出來，因此通常將AMOZ作為監測呋喃它酮的靶化合物[1，4，5]。

目前，AMOZ 檢測方法主要有色譜法[6～9]、免疫分析法[10] 等。色譜法準確、靈敏，但操作復雜、設備昂貴、檢測速度慢，需要專業技術人員。而免疫分析法具有簡單、快速、靈敏度較高、特異性強和高通量等優點。免疫分析法的關鍵是高親和力和特異性的抗體的制備，其中基因工程重組單鏈抗體是將天然抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL通過一條柔軟的連接肽連接成的單鏈分子，不僅具有高親和力和特異性，而且還可以通過工程菌發酵快速大量制備，極大地降低了抗體生產成本，縮短了抗體生產周期。化學發光免疫分析是近十年來發展起來的一項將高靈敏度的化學發光與高特異的免疫分析相結合的新興的免疫檢測技術，具有檢測特異性好、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高等優點，能顯著提高檢測的靈敏度，并且比常用的其他免疫分析法的靈敏度都高[11～14]。迄今為止，文獻報道的AMOZ免疫分析法都是建立在傳統的多克隆或單克隆抗體基礎上的ELISA法，利用重組單鏈抗體建立的AMOZ化學發光酶免疫分析方法還未見報道。本研究利用重組抗AMOZ衍生物單鏈抗體，建立了測定蝦肉中AMOZ殘留的間接競爭化學發光酶免疫分析新方法。本方法簡便、快速、準確、儀器設備簡單，靈敏度高于ELISA法，測定結果和HPLC-MS/MS法測定結果呈現良好的相關性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Wallac Victor3 1420 多標記分析儀（美國Perkin Elmer公司）； Wellwash MK2 洗板機（美國Thermo公司）； 96孔化學發光檢測板條（廈門云鵬生物公司）；1200-6410A型 HPLC-MS/MS聯用儀（美國Agilent公司）；5417R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；JY92-IIN型超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；超濾濃縮設備（美國Millipore 公司）； DK-8D型電熱恒溫水槽（上海醫用恒溫設備廠）；WH-1微型漩渦混合儀和90-2型定時恒溫磁力攪拌器（上海滬西分析儀器廠）；MF1-A10超純水儀（美國Millipore 公司）。

化學發光底物液（美國Pierce公司）；抗His標簽抗體和羊抗鼠IgG-HRP（武漢博士德生物工程有限公司）；呋喃它酮、AMOZ、NPAMOZ以及其它硝基呋喃類抗生素及其代謝物標品（美國Sigma公司）；含有PET22b（+）-AMOZ質粒的抗AMOZ衍生物單鏈抗體陽性克隆菌，由本研究室構建并鑒定；AMOZA-OVA包被原也由本研究室制備，并經質譜和全波長掃描鑒定； 其它試劑均為國產分析純或色譜純；刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）樣品（購于當地農貿市場）。