基于核磁和質(zhì)譜分析技術(shù)的代謝組學(xué)在癌癥診斷中的應(yīng)用

摘 要 本文對(duì)近年來用于癌癥診斷的新方法——代謝組學(xué)及其在該領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹。代謝組學(xué)通過定性與定量測(cè)量生物樣本（血液、尿液、組織等）中數(shù)以千計(jì)的小分子代謝物，可靈敏地反映代謝組中與病理狀態(tài)有關(guān)的細(xì)微變化，從而可為癌癥的早期診斷及更好地理解癌變過程提供一種新穎的思路。本文還討論了代謝組學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)中其它一些組學(xué)在癌癥檢測(cè)上的關(guān)聯(lián)，介紹了一些用代謝組學(xué)進(jìn)行不同癌癥的診斷、治療監(jiān)測(cè)以及藥物開發(fā)的前期研究工作，并探討了用于臨床癌癥診斷的代謝組學(xué)方法所面臨的機(jī)遇、挑戰(zhàn)與未來發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞 核磁共振波譜； 質(zhì)譜； 代謝輪廓分析； 代謝組學(xué)； 癌癥診斷； 腫瘤學(xué)； 評(píng)述

1 引 言

癌癥是世界范圍內(nèi)影響人類健康的主要疾病之一[1]。在美國(guó)每4名死者中就有一名死于癌癥；在中國(guó)，惡性腫瘤也是城鄉(xiāng)居民中死亡率最高的疾病[2]。前列腺癌、乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌是最常見的癌癥。目前，癌癥的最終診斷仍需活體組織切片檢查，并輔以X光、斷層掃描（CT）、核磁共振成像（MRI）檢查，以確定腫瘤的位置和大小。過去十年間，可用于癌癥的診斷、監(jiān)測(cè)和治療的分子水平標(biāo)記物已逐漸引起人們的關(guān)注[3]，比如，通過血液分析可檢測(cè)一些蛋白質(zhì)組和基因組的腫瘤標(biāo)記物。

眾所周知，癌癥的早期準(zhǔn)確診斷不僅能夠提高患者的生存率，而且可以幫助臨床醫(yī)生確定最適合于病人的治療策略，從而避免治療不足或過量。Lu等[4]對(duì)2263例乳腺癌患者開展了13項(xiàng)相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若能盡早預(yù)警乳腺癌的復(fù)發(fā)，每1000名患者中就會(huì)多有5～8人存活，從而可使死亡率（十年）降低17%～28%。然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)手段存在局限性。例如，乳腺X射線攝影診斷技術(shù)會(huì)存在20%～40%的誤判，這在出現(xiàn)早期或較小腫瘤的年輕女性患者身上尤為突出。對(duì)于大多數(shù)案例，蛋白質(zhì)和基因標(biāo)記物存在靈敏度或者特異性不夠高的問題，從而無法真正實(shí)現(xiàn)癌癥早期準(zhǔn)確診斷。因此，為進(jìn)一步提高人們生活和健康水平，迫切需要建立靈敏度高、特異性好的癌癥早期診斷方法。

目前，越來越多的人致力于發(fā)展準(zhǔn)確度更高的癌癥早期診斷新技術(shù)。代謝組學(xué)，又稱代謝輪廓分析，目前發(fā)展迅速，其可通過研究生物樣品內(nèi)代謝物的水平及變化，了解不同生物系統(tǒng)的復(fù)雜生理和病理的狀況[5～9]。由于代謝標(biāo)記物可靈敏地反映機(jī)體的生理狀態(tài)，因此它們可用于癌癥的早期診斷，并最終有助于改善癌癥的治療效果。鑒于代謝組學(xué)所關(guān)注的小分子代謝物是基因和蛋白質(zhì)的終端產(chǎn)物，代謝組學(xué)也可以被視作系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)下游組學(xué)，并可以與其它組學(xué)，如基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，進(jìn)行整合研究和互相驗(yàn)證，從而對(duì)復(fù)雜生物系統(tǒng)進(jìn)行全面而透徹的了解。在癌癥診斷方面，早在19世紀(jì)20年代，著名的Warburg效應(yīng)就已經(jīng)指出癌細(xì)胞的新陳代謝過程發(fā)生了改變[10～12]。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞的原因有可能來自于能量代謝的差別。癌細(xì)胞會(huì)偏向使用糖解作用取代一般正常細(xì)胞的有氧循環(huán)，所以癌細(xì)胞使用粒線體的方式與正常細(xì)胞會(huì)有所不同。由此可見，盡管癌變系由基因突變所引發(fā)，但研究DNA損傷所引發(fā)的代謝變化及其與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)同樣重要，這將有助于理解腫瘤發(fā)展過程中生物系統(tǒng)內(nèi)代謝平衡發(fā)生的轉(zhuǎn)變，有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)以及與疾病相關(guān)的診斷、治療和預(yù)測(cè)生物標(biāo)記物。因此，代謝組學(xué)為癌癥的早期準(zhǔn)確診斷及更好地理解癌變過程提供了一種全新途徑。

圖1為一個(gè)典型的代謝組學(xué)研究的流程。核磁共振（NMR）和質(zhì)譜（MS）是代謝組學(xué)中兩個(gè)最常用的分析技術(shù)。核磁共振重復(fù)性好且具有較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)解析能力。與液相色譜（LC）或氣相色譜（GC）聯(lián)用，質(zhì)譜（MS）在代謝組學(xué)中也是一個(gè)用于定性和定量研究的有力工具。近幾年來，質(zhì)譜學(xué)中敞開式電離技術(shù)（Ambient mass spectrometry）也得到了迅猛發(fā)展，其中包括電噴霧解析電離質(zhì)譜（DESI-MS）、電噴霧萃取電離質(zhì)譜（EESI-MS）、實(shí)時(shí)在線分析質(zhì)譜（DART-MS）等[13～17]。敞開式電離技術(shù)幾乎無需樣品預(yù)處理，可快速并高通量地對(duì)生物復(fù)雜基體樣品進(jìn)行定性和定量分析。多種質(zhì)量分析器，如四級(jí)桿（Q）、三重四級(jí)桿（QQQ）、飛行時(shí)間（TOF）、四級(jí)桿飛行時(shí)間（Q-TOF）、軌道離子阱（Orbitrap），均已頻繁地應(yīng)用到代謝組學(xué)研究領(lǐng)域中。另外，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)通常較復(fù)雜，因此需要靈活運(yùn)用一些多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。作為典型的無監(jiān)督方法，主成分分析（PCA）可直接對(duì)樣本分組進(jìn)行觀察，并提供潛在生物標(biāo)記物的信息。基于訓(xùn)練樣本集，偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、邏輯回歸（Logistic regression）、支持向量機(jī)（SVMs）[18]等有監(jiān)督的方法還可建立預(yù)測(cè)模型以用于未知樣品的分析。需要指出的是，對(duì)于有監(jiān)督方法必須進(jìn)行交叉驗(yàn)證，以有效得到有用信息及避免過度數(shù)據(jù)擬合的情況。

2 典型研究和技術(shù)挑戰(zhàn)

近30年，代謝組學(xué)已成功應(yīng)用到許多領(lǐng)域，如疾病早期檢測(cè)、代謝途徑研究、藥物開發(fā)、毒理學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究等[5～7，19]。許多研究表明，代謝組學(xué)方法可以成功用于不同癌癥的診斷。Bathe等[20]采用1H NMR分析了43例良性膽管疾病患者和56例胰腺癌患者血清樣本中的58種特有的代謝產(chǎn)物，結(jié)果表明，良性與惡性胰腺癌患者的代謝輪廓存在顯著差異（AUROC，接受工作特征曲線下的面積=0.8308）。Odunsi等[21]基于NMR的代謝組學(xué)方法分析了38例上皮性卵巢癌患者，12例良性卵巢囊腫患者及53例健康女性的術(shù)前血清樣本，并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法成功區(qū)分了不同群組，準(zhǔn)確率達(dá)到97%～100%。Rantalainen等[22]結(jié)合代謝組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究前列腺癌的小鼠模型，結(jié)果表明，血清鐵傳遞蛋白母離子與酪氨酸和3D-羥基丁酸酯存在著相關(guān)性，且當(dāng)酪氨酸濃度降低時(shí)，凝溶膠蛋白濃度上升。Chen等[23]采用NMR和DESI-MS聯(lián)用技術(shù)研究肺癌小鼠模型的代謝輪廓，并結(jié)合核磁和質(zhì)譜數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法篩選出了一些差異性代謝物，且其中大部分位于嘌呤代謝路徑中。Fan等[24]結(jié)合NMR與GC-MS技術(shù)，運(yùn)用穩(wěn)定同位素代謝組學(xué)分析法（SIRM）研究了肺癌患者代謝的改變，發(fā)現(xiàn)其中由13C標(biāo)記的乳酸、丙氨酸、琥珀酸鹽、谷氨酸、天門冬氨酸及檸檬酸鹽在糖酵解途徑和檸檬酸循環(huán)（TCA cycle）中表現(xiàn)得異常活躍。Chen等[25]利用LC-MS技術(shù)監(jiān)測(cè)肝癌患者和健康志愿者的尿液代謝物，通過建立PCA和PLS-DA分析模型，發(fā)現(xiàn)了與肝癌相關(guān)的21種潛在的生物標(biāo)記物，且它們與精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸和天冬氨酸代謝、賴氨酸降解、煙酸和煙酸酰胺代謝以及脂肪酸氧化有關(guān)。 圖2 BCR模型與CA27.29性能的ROC曲線[27]

Fig.2 ROC curve of the BCR model and the performance of CA 27.29 [27]

研究乳腺癌的生物標(biāo)記物常采用代謝組學(xué)策略。有研究表明，基于對(duì)NMR數(shù)據(jù)的多變量統(tǒng)計(jì)分析可成功區(qū)分腫瘤組織與正常組織，特異性和靈敏度分別為100%和82%[26]。值得一提的是，Asiago等[27]最近采用血液樣本建立了可早期診斷乳腺癌復(fù)發(fā)的代謝組學(xué)方法（BCR模型）。如圖2所示，與CA 27.29（FDA批準(zhǔn)的一種可用于乳腺癌治療監(jiān)測(cè)的血液免疫分析法）相比，BCR模型能更準(zhǔn)確地篩查出早期復(fù)發(fā)性乳腺癌疾病。作者運(yùn)用該方法成功地預(yù)測(cè)了55%患者的復(fù)發(fā)，比臨床診斷提早13個(gè)月，從而在乳腺癌復(fù)發(fā)的早期診斷方面比CA 27.29方法更具較大優(yōu)勢(shì)。此外，結(jié)合NMR和MS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，整合二者的數(shù)據(jù)，建立了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，以提供一種高通量的分析平臺(tái)來檢測(cè)生物流體或組織樣中的差異性代謝產(chǎn)物[28]，這是代謝組學(xué)的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)，這也將為癌癥診斷的代謝組學(xué)研究提供一個(gè)全新途徑。例如，基于NMR和MS數(shù)據(jù)，Gu等[29]建立了主成分引導(dǎo)的偏最小二乘法（PC-PLS），該方法明顯提高了乳腺癌患者和健康人群的區(qū)分效果，并可為癌癥研究機(jī)理研究提供更多信息。以上工作及類似研究均表明，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行癌癥檢測(cè)具有良好前景。

盡管代謝組學(xué)技術(shù)在癌癥診斷方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，但目前該領(lǐng)域也存在著諸多挑戰(zhàn)。（1） 生物樣本的代謝輪廓很容易受到其它次要因素的影響，如患者年齡、性別、種族、生活習(xí)慣、飲食規(guī)律、藥物使用情況、環(huán)境條件及其他疾病影響等，因此必須對(duì)這些影響進(jìn)行有效控制以盡量獲得僅與研究目標(biāo)相關(guān)的信息。（2） 代謝組學(xué)在癌癥診斷方面的應(yīng)用，還有賴于分析技術(shù)平臺(tái)的發(fā)展。人類約有5000～7000個(gè)可檢測(cè)的代謝產(chǎn)物，它們的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、生物樣品內(nèi)的含量千差萬(wàn)別。因此，借助可檢測(cè)更多代謝物、定量準(zhǔn)確度更高以及對(duì)未知物的定性能力更強(qiáng)的分析技術(shù)平臺(tái)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)手段，可有效地對(duì)與腫瘤相關(guān)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。（3） 代謝組學(xué)診斷癌癥方法的建立及臨床驗(yàn)證是昂貴且耗時(shí)的。為了建立靈敏度高、特異度好的代謝組學(xué)篩查測(cè)試方法，通常需要對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行定性與定量檢測(cè)，且臨床應(yīng)用常需要獲得相關(guān)部門的批準(zhǔn)（例如，美國(guó)食品及藥物管理局的批準(zhǔn)）。（4） 腫瘤機(jī)理和癌癥生物學(xué)尚未完全清楚，如著名的Warburg 效應(yīng)指出癌細(xì)胞的有氧糖酵解作用發(fā)生變化，從而可產(chǎn)生更多乳酸[10，12]，但是與之相關(guān)的能量代謝機(jī)制尚不清楚。另外，大多數(shù)的癌癥機(jī)理研究是以細(xì)胞為對(duì)象的[30，31]，而對(duì)于這些標(biāo)記物在血液中的聯(lián)系及驗(yàn)證的研究則較少，這就可能錯(cuò)失一個(gè)簡(jiǎn)易而方便的代謝組學(xué)早期準(zhǔn)確診斷癌癥的方法。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，代謝組學(xué)在癌癥診斷中具有良好的前景。由于代謝物能夠靈敏地反映出生理和病理狀態(tài)的微小變化（如早期腫瘤的增長(zhǎng)），因此癌癥診斷的代謝組學(xué)方法將具有較高的靈敏度。同時(shí)，由于人體內(nèi)的主要代謝途徑現(xiàn)已清楚，且已有很多與人體代謝物有關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)信息，因此基于代謝組學(xué)的癌癥診斷方法在原則上具有一定優(yōu)勢(shì)[32～34]。此外，將代謝物與基因型和表型相聯(lián)系，將能夠更好地理解復(fù)雜的生物狀態(tài)，并且為病理研究、治療監(jiān)測(cè)和藥物開發(fā)提供新途徑。

未來的癌癥診斷的代謝組學(xué)研究發(fā)展方向?qū)⒓杏诮⒏呒?jí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件以及能夠精確識(shí)別不同種類癌癥的代謝標(biāo)記物的先進(jìn)分析平臺(tái)。代謝輪廓分析和臨床驗(yàn)證仍富有挑戰(zhàn)性，但不是無法攻克的障礙。我們認(rèn)為， 先通過細(xì)胞模型篩選生物標(biāo)記物，再在動(dòng)物模型及患者身上驗(yàn)證其診斷能力，將是比較經(jīng)濟(jì)且有效的做法。可以相信，癌癥代謝研究中的新發(fā)現(xiàn)必將為癌癥早期診斷帶來新的福音。

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References

1 Siegel R， Naishadham D， Jemal A. CA. Cancer J. Clin.， 2012， 62（1）： 10-29

2 Ministry of Health， the People′s Republic of China. Report on the Third National Sampling Survey of Causes of Death. Beijing： The People′s Health Press， 2008

3 Belkowski S M， Polkovitch D， D′Andrea M R. Curr. Top. Med. Chem.，  2005， 5（11）： 1047-1051

4 Lu W L， Jansen L， Post W J， Bonnema J， Velde J C V d， Bock G H D. Breast Cancer Res. Treat.， 2009， 114（3）： 403-412

5 Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. Xenobiotica， 1999， 29（11）： 1181-1189

6 Gowda G A N， Zhang S C， Gu H W， Asiago V， Shanaiah N， Raftery D. Expert Rev. Mol. Diagn.， 2008， 8（5）： 617-633

7 Fiehn O. Plant Mol. Biol.， 2002， 48（1-2）： 155-171

8 Wu Z M， Huang Z Q， Lehmann R， Zhao C X， Xu G W. Chromatographia， 2009， 69： S23-S32

9 Tang H R， Wang Y L. Prog. Biochem. Biophys.， 2006， 33（5）： 401-417

10 Heiden M G V， Cantley L C， Thompson C B. Science， 2009， 324（5930）： 1029-1033

11 Samudio I， Fiegl M， Andreeff M. Cancer Res.， 2009， 69（6）： 2163-2166

12 Warburg O. Science， 1956， 123（3191）： 309-314

13 Takats Z， Wiseman J M， Gologan B， Cooks R G. Science， 2004， 306（5695）： 471-473

14 Cooks R G， Ouyang Z， Takats Z， Wiseman J M. Science， 2006， 311（5767）： 1566-1570

15 Cody R B， Laramee J A， Durst H D. Anal. Chem.， 2005， 77（8）： 2297-2302

16 Chen H W， Venter A， Cooks R G. Chem. Commun.， 2006， （19）： 2042-2044

17 Gu H W， Xu N， Chen H W. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 403（8）： 2145-2153

18 Broadhurst D I， Kell D B. Metabolomics， 2006， 2（4）： 171-196

19 Raftery D， Gowda G A N. J. Urol.， 2008， 179（6）： 2089-2090

20 Bathe O F， Shaykhutdinov R， Kopciuk K， Weljie A M， Mckay A， Sutherland F R， Dixon E， Dunse N， Sotiropoulos D， Vogel H J. Cancer Epidem. Biomar.， 2011， 20（1）： 140-147

21 Odunsi K， Wollman R M， Ambrosone C B， Hutson A， McCann S E， Tammela J， Geisler J P， Miller G， Sellers T， Cliby W， Qian F， Keitz B， Intengan M， Lele S， Alderfer J L. Int. J. Cancer， 2005， 113（5）： 782-788

22 Rantalainen M， Cloarec O， Beckonert O， Wilson I D， Jackson D， Tonge R， Rowlinson R， Rayner S， Nickson J， Wilkinson R W， Mills J D， Trygg J， Nicholson J K， Holmes E. J. Proteome Res.， 2006， 5（10）： 2642-2655

23 Chen H W， Pan Z Z， Talaty N， Raftery D， Cooks R G. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2006， 20（10）： 1577-1584

24 Fan T W， Lane A N， Higashi R M， Farag M A， Gao H， Bousamra M， Miller D M. Mol. Cancer， 2009， 8： 41

25 Chen J， Wang W Z， Lv S， Yin P Y， Zhao X J， Lu X， Zhang F X， Xu G W. Anal. Chim. Acta， 2009， 650（1）： 3-9

26 Sitter B， Lundgren S， Bathen T F， Halgunset J， Fjosne H E， Gribbestad I S. NMR Biomed.， 2006， 19（1）： 30-40

27 Asiago V M， Alvarado L Z， Shanaiah N， Gowda G A N， Owusu-Sarfo K， Ballas R A， Raftery D. Cancer Res.， 2010， 70（21）： 8309-8318

28 Pan Z Z， Raftery D. Anal. Bioanal.Chem.， 2007， 387（2）： 525-527

29 Gu H W， Pan Z Z， Xi B W， Asiago V， Musselman B， Raftery D. Anal. Chim. Acta， 2011， 686（1-2）： 57-63

30 Wang D J， Bodovitz S. Trends Biotechnol.， 2010， 28（6）： 281-290

31 D′Alessandro A， Zolla L. Drug Discov. Today， 2012， 17（1-2）： 3-9

32 Wishart D S， Tzur D， Knox C， Eisner R， Guo A C， Young N， Cheng D， Jewell K， Arndt D， Sawhney S， Fung C， Nikolai L， Lewis M， Coutouly M A， Forsythe I， Tang P， Shrivastava S， Jeroncic K， Stothard P， Amegbey G， Block D， Hau D D， Wagner J， Miniaci J， Clements M， Gebremedhin M， Guo N， Zhang Y， Duggan G E， MacInnis G D， Weljie A M， Dowlatabadi R， Bamforth F， Clive D， Greiner R， Li L， Marrie T， Sykes B D， Vogel H J， Querengesser L. Nucleic Acids Res.， 2007， 35： D521-D526

33 Kanehisa M. I(xiàn)n Silico Simulation of Biological Processes， 2002， 247： 91-103

34 http：//webbook.nist.gov/chemistry/

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Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy and Mass

Spectrometry-based Metabolomics for Cancer Diagnosis

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GU Hai-Wei1， QI Yun-Peng2， XU Ning1， DING Jian-Hua1， AN Yan-Bo1， CHEN Huan-Wen*1

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1（Jiangxi Key Laboratory for Mass Spectrometry and Instrumentation，

East China Institute of Technology， Nanchang 330013， China）

2（Department of Pharmaceutical Analysis， School of Pharmacy，

Second Military Medical University， Shanghai 200433， China）

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Abstract In this review， we aim to introduce a relatively new approach， metabolomics， and exploreits potential for cancer diagnosis. We will briefly introduce the concept of metabolomics and its relationship with other omics studies in systems biology for cancer detection. The field of metabolomics focuses on the parallel measurement of hundreds of small molecule metabolites in biological samples such as blood， urine， and biopsied tissue. Since metabolite levels are sensitive to subtle changes in the pathological status， metabolomics promises novel avenues for early cancer detection and a better understandingof cancer processes. In fact， many previous metabolomics studies have clearly demons-tratedthe promises of metabolomics not only for the diagnosis of various kinds of cancer， but also for therapeutic monitoring as well as for drug development. In addition， in this review we will discuss the challenges and future directions for developing metabolomics methods towards clinical applicationsfor cancer diagnosis.

Keywords Nuclear magnetic resonance spectroscopy； Mass spectrometry； Metabolic profiling； Metabolomics； Cancer diagnosis； Oncology； Review

（Received 28 May 2012； accepted 20 September 2012）