大長徑比金納米棒的合成及其單細胞毒性研究

摘 要 利用三步晶種生長法合成長徑比約為14的大長徑比金納米棒（GNR），利用巰基十一酸（MUDA）對金納米棒表面進行了生物適應性修飾，并在宏觀水平上研究了修飾前后的金納米棒在對細胞活性的影響。利用單細胞方法分別考察了修飾后的納米金棒對細胞貼壁過程、增殖速率、細胞內ROS以及骨架排布的影響。雖然MTT細胞活性結果顯示內吞后的金納米棒對細胞無毒，但單細胞毒性分析方法發現，不同濃度納米金棒對早期貼壁過程有較小的影響，且內吞的納米金棒在一定程度上促進了細胞的增殖，而高濃度下納米金棒引起了細胞內ROS含量的升高，并破壞了細胞內骨架纖維排布。本研究建立了用單細胞行為分析納米顆粒對細胞毒性的方法，證明了以往僅僅利用MTT等宏觀手段分析納米材料生物適應性是不足的。納米材料在生物醫學領域的進一步應用還應考慮單細胞及分子水平上的毒性效應。

關鍵詞 大長徑比金納米棒； 表面修飾； 細胞毒性

1 引 言

金納米棒是一種棒狀的金納米顆粒，特殊的形狀使其具有更為奇特的性質，金納米棒的縱向等離子共振峰會隨著長徑比的增大向近紅外區移動。由于可見光不容易穿透生物組織，而大長徑比的金納米棒在近紅外光區對光的吸收和散射能力都很強，因此對于皮下組織的癌癥治療和診斷具有更好的選擇性[1，2]。

金納米棒在生物體的廣泛應用，使得研究不同物理和化學性質的金納米棒對細胞的影響變得十分重要[3]。尤其是金納米棒的表面化學對其生物行為的影響[4]。對不同種類納米顆粒的研究表明，納米顆粒的表面化學強烈影響它的細胞毒性和細胞內吞[5～10]。金納米棒合成過程需要用十六烷基溴化銨（CTAB）作為金納米棒生長的保護劑和軟模板，但CTAB顯示出了嚴重的細胞毒性[10～12]。為了降低金納米棒的毒性效應，許多對其表面修飾的方法應運而生，例如利用聚合物[10]和磷脂[13]包裹表面帶CTAB的金納米棒，或是用其它分子如HS-PEG來置換金納米棒表面的CTAB分子[6]。

通常，評估金納米棒毒性的主要方法是對細胞的活性進行表征，采用的方法都是宏觀測量的平均結果，如MTT細胞活性測量法等。這些方法一般取的都是長時間培養后大量納米棒對很多細胞的平均毒性。而近年的研究發現，這種平均測量結果已經無法很好地反映納米材料的生物適應性。金納米棒暴露于細胞后不僅只對細胞的增殖和內吞產生影響[14]，長時間的暴露還可能會引發細胞內氧化壓力的變化，可能會導致細胞凋亡或其它復雜的細胞反應[15，16]。這就需要在單細胞水平上實時原位研究金納米棒與細胞的相互作用。目前，單細胞水平上表征細胞活性的方法主要以染色為主。在納米材料被細胞內吞進入細胞之后所引起的細胞各個功能的影響都有相對應單細胞分析方法。當體外粘附培養的細胞傳代之后，具有一定的貼壁周期，通過考察內吞有納米材料的細胞傳代后細胞貼壁面積以及細胞伸展形態隨貼壁時間的變化可以考察納米材料對貼壁的影響。接著，通過統計細胞數量隨細胞增殖時間的變化，可以考察細胞增殖速率。再者，內吞納米材料之后，對細胞內分子的調節和影響也有方法可以進行單細胞分析，如細胞內氧化壓力（ROS）水平，可以通過對應的ROS染料（DCFH-DA）進行表征，熒光越強，表示ROS水平越高。納米材料進入細胞后對細胞骨架的調節也可通過對骨架識別的染料（Phalloidin-FITC）進行分析。

本研究先合成長徑比約為14的大長徑比金納米棒，利用巰基十一酸（MUDA）對金納米棒表面進行修飾。在宏觀水平上，采用MTT細胞活性表征法研究了GNR-MUDA對細胞的毒性；在單細胞水平上，分析了GNR-MUDA對細胞貼壁周期、增殖速率、細胞內ROS以及細胞骨架排布的影響。這些單細胞分析方法可以被推廣用于研究其它納米粒子的生物適應性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

85-Z型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；DK-S22恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；DGX-9143BC-1電熱鼓風干燥箱（上海福瑪實驗設備有限公司）；Centrifuge 5415D型離心機（Eppendorf公司）；超凈工作臺；CO2培養箱（Thermo公司）；CKX 41相差顯微鏡（日本Olympus公司）；CRX6型干熱滅菌箱（上海精宏實驗設備有限公司）；Malvern Zetasizer Nano儀；JEOL-1230型透射電子顯微鏡；酶標儀；低溫離心機； Nikon Eclipse 80i正置顯微鏡；Nikon 60 ×（NA 0.7-1.25）鏡頭；Olympus DP72彩色CCD攝像機；超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，99%）， HAuCl4·3H2O（99.99%）， NaBH4（98%）， 抗壞血酸（AA，99.7%）， 濃HCl（38%）， 濃HNO3（分析純），均購自上海國藥集團化學試劑有限公司； 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、細胞基礎培養基（Dulbecco's mdification of eagle's medium，DMEM）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4）、抗生素（Penicillin-streptomycin）、胰蛋白酶Typsin-EDTA（0.05%，0.25%）， 均購自美國GIBCO公司；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、70%酒精， 均購自北京鼎國生物科技有限公司。巰基十一酸（MUDA）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、鬼筆環肽（Phalloidin-FITC）、2′，7′-二氯氫化熒光素（2′，7′-dichlorodihydrofluorescin diacetate，DCFH-DA）， 均購自美國Sigma公司。實驗用水均由Millipore公司的超純水裝置（TANKPE030）制備的二次蒸餾水。