發酵過程葡萄糖在線檢測系統的研制

摘 要 發酵工藝中的高溫蒸氣滅菌過程使得傳統“酶膜”方式葡萄糖生物傳感器不能在線使用，導致不能實時控制葡萄糖的補加量，進而影響發酵的質量和產率。為了解決這一問題，本研究構建了一套用于發酵過程的葡萄糖在線檢測系統。利用研制的耐高溫的“酶液”方式葡萄糖生物傳感器解決了“酶膜”方式傳感器高溫后無法正常工作的問題；利用研制的耐高溫的透析取樣系統解決了在線取樣難題。實驗表明： 本傳感器對葡萄糖的靈敏度達到0.259 nA/（mg/L）； 檢出限為0.7 mg/L。 對于500 mg/L葡萄糖濃度測量結果的相對標準偏差為2.02%；在0～1000 mg/L范圍內，系統響應信號與葡萄糖濃度呈線性關系；本系統與商品化SBA-40E 生物傳感分析儀離線測量結果相比，呈現顯著的線性相關關系。且線性相關方程的斜率k≈1。利用此檢測系統對大腸桿菌發酵過程中的葡萄糖濃度進行了在線測量，并與SBA-40E 生物傳感分析儀離線測量結果進行了對比，變化趨勢基本一致。

關鍵詞 發酵過程； 葡萄糖濃度； 在線測量； 酶注射式； 生物傳感器

1 引 言

葡萄糖是發酵過程中菌體生長和產物合成的主要碳源，但必須控制其在發酵液中的濃度。在發酵前期，如果葡萄糖濃度過高，容易對菌體生長產生阻遏、抑制和限制作用；在發酵后期，如果葡萄糖濃度過低，則會限制菌體生長和產物合成。需特別注意的是流加的葡萄糖量，即使是超出最適濃度范圍的微小波動都將引起嚴重的阻遏或限制。在發酵過程中，為了防止染菌，發酵罐等設備需要經過高溫蒸氣滅菌，這會導致常用的“酶膜式”葡萄糖生物傳感器所用的生物酶的活性下降或喪失[1]。因此，葡萄糖濃度一般都通過在實驗室離線化驗取樣樣本獲得。依據測定結果實施間歇式的補料，而間歇式補料容易引起糖濃度的劇烈變化，造成罐內環境（如滲透壓）不穩定，從而對菌體代謝活性及最終發酵生產帶來負面影響，進而影響發酵的產率和質量。因此，葡萄糖在線測量儀器的研制具有重要意義。

與常見葡萄糖檢測方法，如菲林滴定法[2]、氧化酶-偶聯比色法（GOD-POD法）[3]、氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5]及氣相色譜-質譜法[6]相比，葡萄糖氧化酶-電極法[7～10]具有特異性強、適于在線、分析速度快等優點。因此，以葡萄糖氧化酶-電極法為原理的葡萄糖酶電極生物傳感器（以下簡稱為葡萄糖生物傳感器）及以葡萄糖生物傳感器為核心部件的葡萄糖分析儀均得到了廣泛地研究與應用[11]。例如，美國YSI公司的YSI2300 STAT PLUS葡萄糖乳酸分析儀、德國EKF公司的BIOSEN C_Line葡萄糖/乳酸分析儀和中國山東省科學院生物研究所研制的SBA系列生物傳感分析儀，均采用“酶膜”方式葡萄糖生物傳感器，主要用于醫療血糖及發酵工業葡萄糖的離線測量，由于酶的生物活性經高溫滅菌會失活，因此“酶膜”方式葡萄糖生物傳感器不能與發酵罐直接連接，導致不能在線使用[1]。瑞典Chemel AB 公司的SIRE系列葡萄糖分析儀，采用“識別物質注射”方式葡萄糖生物傳感器，主要用于食品、發酵工業葡萄糖的離線測量。該生物傳感器采用的探頭方式，通過透析膜將傳感器與待測液隔開。如果將探頭插入發酵罐中，注射的酶液、流入的緩沖液以及酶促反應后的廢液將會污染發酵液，因此不能直接插入發酵罐中進行葡萄糖濃度的在線測量[12]。而Min等利用在線FIA結合微透析取樣和雙生物傳感器，實現了發酵過程葡萄糖和L-乳酸的同時監測[13～15]。

本研究構建了發酵過程的葡萄糖在線檢測系統（以下簡稱為檢測系統）。其中，研制的新型酶注射式葡萄糖生物傳感器，能夠承受高溫蒸氣滅菌，并因采用“新鮮”酶液，而不用頻繁校準，其對葡萄糖的靈敏度達到0.259 nA/（mg/L）；檢出限為0.7 mg/L。對于500 mg/L葡萄糖濃度測量結果CV值為2.02%[16]；自行設計的透析取樣系統實現了檢測系統的在線取樣，同時減少了待測液的消耗。通過相關實驗研究，驗證了此檢測系統應用于葡萄糖濃度在線測量的可行性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SBA-40E葡萄糖生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所）。葡萄糖標準液，來自山東省科學院生物研究所。磷酸鹽緩沖液，由山東省科學院生物研究所SBA系列分析儀專用緩沖劑添加蒸餾水配制。葡萄糖氧化酶液，由葡萄糖氧化酶（型號G7141，312 U/mg，美國Sigma公司）添加磷酸鹽緩沖液配制。

2.2 葡萄糖在線檢測系統

本研究構建的葡萄糖在線檢測系統結構如圖1所示。系統主要由透析取樣系統、酶液定量注射裝置、酶注射式葡萄糖生物傳感器、三電極檢測電路（即恒電位儀電路[17～19]）和DSP數據采集電路等組成。

系統工作過程如下：首先透析取樣探頭從待測場合（如發酵罐）中提取待測液（如發酵液），并通過待測液定量注射裝置將待測液定量注射入酶注射式葡萄糖生物傳感器。與此同時，酶液定量注射裝置也將定量的葡萄糖氧化酶注射入傳感器。葡萄糖與葡萄糖氧化酶在三電極檢測電路系統作用下發生酶促反應，產生與待測液中葡萄糖濃度成比例的電流信號。電流信號經過DSP數據采集電路和上機位采集并存儲。

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2.3 酶注射式葡萄糖生物傳感器

發酵過程中葡萄糖的在線檢測要求所使用的檢測系統能夠承受在線的高溫蒸氣滅菌。因而研制了耐高溫的新型酶注射式葡萄糖生物傳感器，其作為檢測系統的核心部件，采用了非固定化酶方式[12，20]。酶注射式葡萄糖生物傳感器的結構如圖2A所示。其中三電極裝置的工作電極、對電極和參比電極分別采用Pt， Ag和Ag/AgCl電極制成，而反應池的外結構體及電極體均采用耐高溫的PEEK材料制成。

酶注射式葡萄糖生物傳感器使用的是外來注射的酶液，而非傳統的需安裝在電極表面的酶膜，即所研制的傳感器本身不含具有生物活性的酶。另外，所研制的傳感器和透析取樣系統所用材料均耐高溫，因此檢測系統可以始終保持與待測場合（如發酵罐）相連接，即使待測場合（如發酵罐）的溫度很高時，對此傳感器也無損害和影響，故可實現復雜過程（如發酵過程）下葡萄糖濃度的在線測量。

2.4 透析取樣系統