核酸適體識(shí)別熒光法檢測(cè)汞離子

摘 要 通過(guò)對(duì)已知的Ni2+適體的改造，發(fā)現(xiàn)了對(duì)Hg2+有較強(qiáng)結(jié)合活性的核酸適體N1，基于N1的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，獲得了具有較高活性的核酸適體N5，并建立了熒光檢測(cè)方法。以熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記核酸適體，在94 ℃變性5 min，室溫（25 ℃）下復(fù)性30 min后，適配體與標(biāo)記有熒光猝滅基團(tuán)DABCYL的一段互補(bǔ)序列Q2結(jié)合（適體與Q2的濃度比為1∶3），加入系列濃度的Hg2+與互補(bǔ)序列競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核酸適體，以熒光信號(hào)的變化定量分析Hg2+濃度。結(jié)果表明，N1與Hg2+結(jié)合呈線性，線性范圍為1.25～20 mg/L； 檢出限為0.62 mg/L； 以N1結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)改造合成的序列和結(jié)構(gòu)均不同的適體N4， N5， N6， N7對(duì)Hg2+的識(shí)別結(jié)合活性均不同，其中適體N5與Hg2+結(jié)合活性最為靈敏，特異性高，線性范圍為0.156～2.50 mg/L； 檢出限為78

關(guān)鍵詞 核酸適體； 熒光； 汞離子； 檢測(cè)

1 引 言

重金屬元素的定性與定量檢測(cè)在環(huán)境監(jiān)測(cè)、廢棄物管理、發(fā)育生物學(xué)及臨床毒理學(xué)等領(lǐng)域中具有很大的應(yīng)用價(jià)值，而目前重金屬元素的檢測(cè)主要采用光譜法，包括原子吸收光譜[1]、原子發(fā)射光譜法[2]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[3]以及電化學(xué)法等方法[4，5]。但這些方法依賴(lài)于大型儀器和專(zhuān)人操作，并且需要繁瑣的樣品預(yù)處理和濃縮過(guò)程，在現(xiàn)場(chǎng)和野外檢測(cè)中受到限制。因此研究無(wú)污染、簡(jiǎn)便快速、高靈敏度和高特異性的方法進(jìn)行微量金屬離子的檢測(cè)十分必要。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及核酸適體的篩選應(yīng)用，特別是SELEX技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)獲得對(duì)金屬離子（如Ca2+， Zn2+， Ni2+等）具有活性的核酸適體[6～8]，以及基于核酸適體所建立的各種檢測(cè)方法[9，10]，包括熒光法、電化學(xué)法和比色法等。本研究利用已公開(kāi)發(fā)表的金屬離子適體進(jìn)行改造應(yīng)用，建立更加簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)方法。

通過(guò)對(duì)Ni2+的RNA適體進(jìn)行改造，期望獲得兩條原本針對(duì)Ni2+起作用的DNA適體，即DNA1-B（N1）。但實(shí)驗(yàn)表明，N1對(duì)Ni2+不起作用，對(duì)Hg2+卻有較強(qiáng)的結(jié)合作用[8]。核酸適體標(biāo)記有熒光基團(tuán)FAM，再與標(biāo)記有熒光猝滅基團(tuán)DABCYL的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，通過(guò)加入Hg2+與互補(bǔ)序列競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適體而引起的熒光信號(hào)變化，可定量分析Hg2+[11，12]。據(jù)此可設(shè)計(jì)出多種寡核苷酸的Hg2+檢測(cè)方法，如熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換法[12，13]、膠體金檢測(cè)法[14]、熒光染料法[15]；但均是采用核苷酸鏈中的胸腺嘧啶（T）可與汞配位的原理構(gòu)筑器件，其核苷酸一級(jí)序列單一，二級(jí)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單甚至無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)。本研究表明，與Hg2+有作用的適體N1與此前所使用的多數(shù)適體結(jié)構(gòu)不同；對(duì)N1序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，得到與Hg2+作用更靈敏的新適體N5。本方法只需將樣品簡(jiǎn)單處理直接加樣反應(yīng)即可，且樣品用量少，適用于實(shí)際樣品中Hg2+的檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分