新型微梁陣列生化傳感器的研制

摘 要 為了消除單微梁生化傳感系統中存在的溫度漂移、溶液折射率變化等環境噪聲影響，同時實現多種靶標分子的快速并行檢測，設計制作了新型微梁陣列生化傳感器。利用壓電驅動激光束掃描微梁陣列，并通過光杠桿法實時讀出微梁彎曲信號，即可得到在微梁表面發生的特異性生化反應的動力學曲線。對250 m間距的兩定點的9 h掃描實驗數據驗證了系統光路的穩定性；同時進行了溫度激勵測試，升溫6 ℃后微梁陣列彎曲信號基本保持一致（誤差6.5%），驗證了系統檢測的可靠性。最后，利用自制毛細管陣列套合修飾裝置，成功將克倫特羅抗體修飾到微梁陣列一側的金表面上，對待測液中10 g/L克倫特羅標樣進行了準確檢測，驗證了此傳感系統在生化檢測中的實際可行性。

關鍵詞 生化傳感器； 無標記； 微梁陣列； 壓電驅動； 光杠桿法； 毛細管陣列

1 引 言

微梁生化傳感技術是在原子力顯微鏡和微機電系統基礎上發展起來的一項新興傳感技術\\，具有檢測靈敏度高、無需標記、能實時原位再現生化反應信息等優點。其檢測原理是：當微梁單側表面上有生化反應發生時，分子間的相互作用會導致微梁表面應力改變而使微梁產生彎曲，利用光學或電學方法檢測出此變形即可得到該生化反應過程信息。經過近十年發展，微梁傳感技術的應用領域已從最初的濕度、溫度測量\\逐漸轉變到了生物工程\\、環境污染監測\\等。自2002年，本研究組以先后利用該技術實現了對聚N異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）構象轉變\\、Cu2＋\\、克倫特羅（又稱瘦肉精）和氯霉素\\、紫杉醇\\等的檢測研究。

為進一步消除溫度漂移、溶液折射率變化等環境噪聲對單微梁檢測系統\\的影響，同時實現多種靶標分子的快速并行檢測，研發了微梁陣列傳感技術。目前，已報道的微梁陣列傳感研究方法主要有光學干涉法\\、垂直共振腔面射型激光器（VCSELs）時序照射檢測法\\和CCD面光源檢測法\\等。這些方法各有優缺點：光學干涉法檢測靈敏度高，但所需檢測條件過于苛刻，對系統抗振性能要求極高，在實際運用中很難實行；VCSELs時序照射檢測法能實現8根微梁的高靈敏檢測，但由于發射光束間距不可調，只能針對一定間距的微梁陣列進行檢測，靈活性較低，且價格昂貴；CCD面光源檢測法能實現高通量檢測，但由于微梁尖端的彎曲會使圖像產生彌散，嚴重影響光斑位移的檢測質量，導致其檢測靈敏度不高。

本研究基于壓電掃描原理提出了微梁陣列生化傳感方法。與已有的檢測方法相比，本方法具有原理簡單、靈敏度高、調節方便，可以對任意間距微梁陣列進行快速定位檢測的優點。同時，研制了毛細管陣列套合修飾裝置，能有效地將生化分子修飾到微梁陣列上，修飾效率比已有商品化點樣儀更高，且成本更低。利用此裝置成功消除了檢測環境中的溫度漂移、溶液折射率變化等噪聲影響，對待測液中10 g/L克倫特羅標樣進行了準確檢測。

2 檢測原理

微梁傳感方法對生化反應的監測過程，實際上是通過檢測生化分子在微梁單側表面相互作用時引起的表面應力變化實現的。根據Stoney公式\\，微梁端部位移δ與其表面應力變化量Δσ之間存在以下關系：

δ＝3（1－v）l2Et2Δσ（1）

其中，l， t， E和v分別代表微梁的長度、厚度、楊氏模量和泊松比。從式（1）可見，當微梁的材料與幾何參數確定后，δ與σ成正比，檢測出微梁端部位移即可得到其表面應力變化情況，進而檢測出對應的生化反應信息。 圖1 微梁陣列檢測示意圖

Fig．1 Detecting schematic of microcantilever array

目前，對微梁彎曲變形的檢測方法主要有電容、壓阻、光學和電磁檢測法等\\。其中，光杠桿法由于結構簡單、靈敏度高，在目前使用最普遍，其垂直分辨率可達1011 m量級\\。基于該方法，對微梁陣列上生化反應信息進行準確檢測的原理圖如圖1所示：在生化反應過程中，利用修飾了惰性分子（不參與生化反應）的參考梁檢測環境噪聲信號；待反應完成后，修飾有探針分子的微梁變形信號減去參考梁的變形信號，即得到了僅由探針分子與靶標分子特異性結合產生的微梁變形信號。

 分 析 化 學第40卷

第4期鄔 林等： 新型微梁陣列生化傳感器的研制 

3 結果與討論

3.1系統設計

利用壓電掃描原理設計制作的微梁陣列生化傳感系統如圖2a所示：利用壓電陶瓷管驅動固定在其上的凸透鏡做周期性往復運動，使穿過其中的激光束掃射微梁陣列（圖2b），用PSD靶面時序接收反射光點位置信號，即可實現微梁陣列彎曲變形檢測，獲得梁上生化反應的實時信息。

圖2 （a）微梁陣列生化傳感系統示意圖和（b）壓電驅動掃描原理圖

Fig．2 （a） Schematic of microcantilever array biochemical sensor and （b） Schematic of piezodriven scanning

凸透鏡偏轉驅使激光束掃描的原理圖如圖3所示，當壓電陶瓷管由于其輸入電壓值變化產生偏轉時，固定在其上的凸透鏡也隨之發生偏轉（中心位置從O點移動到O’點），此時，經凸透鏡匯聚后的激光束焦點也相應地從F1處移動到F2處。通過程序控制輸入電壓的大小和變化周期，即可準確控制掃描光束的間距和頻率。

圖3 透鏡驅使激光束掃描原理圖Fig．3 Schematic of laser beam deflecting with lens

圖4 實驗用微梁陣列照片

Fig．4 Photo of microcantilever array used in experiment

3.2 掃描光路穩定性測試

將商品化微梁陣列（德國Micromotive公司，如圖4所示，其中微梁長500 m的兩定點進行9 h掃描測試。結果表明：在X方向和Y方向上，兩掃描位點位移都保持平穩一致，證實了掃描光路的穩定性。

3.3 陣列信號一致性測試

調節激光束掃描位點，準確定位微梁1和2尖端，待信號穩定后進行溫度激勵測試。采用高精度溫控器（精度0.01 ℃）將微梁陣列的環境溫度從22 ℃逐步升至28 ℃， 圖5 在溫度激勵下兩微梁的位移曲線圖Fig．5 Displacement of two microcantilevers versus

temperature

所得對應數據曲線如圖5所示（圖中將兩梁信號曲線平移到了原點）。實驗表明，兩微梁的位移響應信號在同一溫度變化激勵下基本保持一致，在升溫6 ℃后，誤差6.5%（相差量26 nm除以總的變形量400 nm）。由于微梁傳感技術對生化反應的檢測主要是針對分子間的特異性結合，因此只要能準確測出這種特有的反應信息，微梁陣列彎曲信號誤差在10%以內是不會影響檢測結果的，目前已有的商品化VCSELs型微梁陣列儀（瑞士Concentris公司）檢測精度也在此量級，如圖6所示。

為進一步測試陣列系統可靠性，將微梁陣列安放在生化反應池中進行實驗。模擬實際生化反應環境，開啟蠕動泵使池中溶液流動置換，調節好掃描光路，在實驗室自然環境下采集信號8 h，得到圖7所示信號曲線。兩根微梁的位移曲線變化趨勢在隨環境變化（溫度、溶液流動等）過程中始終保持平行，說明在相同的外在激勵條件下，微梁陣列響應信號一致，進一步驗證了系統可靠性。

圖6 VCSEL型微梁陣列儀溫度激勵數據圖Fig．6 Temperature excitation graph of VCSELs

microcantilever array sensor

圖7 在自然環境下兩微梁的位移曲線圖Fig．7 Displacement curves of two microcantilevers in the natural environment

3.4 特異性生化反應檢測

3.4.1 實驗試劑 克倫特羅抗體，克倫特羅標準樣品（CLEN），氯霉素標準樣品（CAP）均取自中國農業大學農學與生物技術學院；活化劑： 1Ethyl3（3dimethyl aminopropyl） carbodiimide （EDC），NHydroxysulfosuccinimide （NHS）；硫醇 HSCH2COOH （Sigma公司）；PBS （4.0 g NaCl＋0.1g KH2PO4＋1.48 g Na2HPO4·H2O＋500 mL去離子水）；TPBS （PBS＋0. 5% Tween20）；98%濃H2SO4；30% H2O2，均為分析純。

3.4.2 微梁陣列上抗體的修飾 將微梁陣列浸入H2O2H2SO4（1∶3， V/V）混合溶液中10 min（室溫），洗去雜質，取出用去離子水沖洗后放入孔板中，加入200 L 0.1 mol/L硫醇后，封口靜置20 h（室溫），利用硫醇自帶的巰基（HS）自組裝到微梁陣列一側的鍍金表面上。反應完成后，取出微梁陣列，依次用乙醇和去離子水沖洗，放入新孔板中，注入100 g/L CLEN標樣，此時修飾有克倫特羅抗體的梁1響應信號明顯大于未修飾克倫特羅抗體的梁2響應信號，說明：梁1上發生了克倫特羅抗原抗體特異性結合，導致了其表面應力的顯著變化；梁2的響應信號幅度較小，可能是由環境擾動引起。將梁1與梁2（參考梁）響應信號之差，即為僅由克倫特羅抗原抗體特異性結合產生的真實微梁變形信號（38 nm）。

圖8 利用毛細管修飾CLEN抗體到微梁陣列上照片

Fig．8 Photo of immobilizing clenbuterol （CLEN） antibody on microcantilever array with capillary

圖9 微梁陣列對CLEN抗原抗體特異性結合的檢測

Fig．9 Detection of CLEN antigenantibody specific binding with microcantilever array

微梁生化檢測過程中，抗原抗體結合導致微梁上表面應力變化的機理， 目前認為主要是由親疏水作用、靜電力和氫鍵等導致\\。對于本實驗檢測用的CLEN而言， 認為主要是由靜電排斥力導致。根據公式（1），帶入相關參數，計算可得10

g/L CLEN標樣與梁上修飾的CLEN抗體發生特異性結合后，導致了微梁上約0.0184 N/m的表面應力變化。

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A Novel Microcantilever Array Biochemical Sensor

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WU Lin1， ZHOU XiaRong1， WU ShangQuan1， WANG Ping2， ZHANG QingChuan*1， WU XiaoPing1

1（Key Laboratory of Mechanical Behavior and Design of Material of Chinese Academy of Sciences，

University of Science and Technology of China， Hefei 230027， China）

2（Laboratory of Physical Biology， Shanghai Institute of Applied Physics，Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201800， China）

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Abstract To eliminate the impact of environmental noise such as temperature drift and change ofliquid refractive index in the single microcantilever biochemical sensing system and achieve rapid parallel detection of a variety of target molecules， a novel microcantilever array biochemical sensor was designed and manufactured. When the microcantilever array was scanned by a piezoelectricdriven laser beam， the kinetic curves of the specific biochemical reaction on the microcantilever array surface was obtained by realtime monitoring the deflections of the microcantilevers with the optical lever readout technique. In the experiment， the system optical stability was verified by 9 h scanning of two fixed points with 250