高效液相色譜法同時測定食品中6種對羥基苯甲酸酯

摘 要 建立了同時檢測食品中6種對羥基苯甲酸酯的高效液相色譜二極管陣列檢測器（HPLCDAD）定量分析方法。樣品用乙腈提取，經LCC18固相萃取柱凈化，采用Agilent C18色譜柱分離，甲醇/水溶液梯度洗脫，二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。結果表明：6種對羥基苯甲酸酯在1.0～500.0 mg/L范圍內線性關系良好（r≥0.9997）；檢出限為0.0016～0.0081 mg/L（S/N＝3）；6種對羥基苯甲酸酯各添加水平在經表面處理的新鮮蔬菜、水果、醋、碳酸飲料及牛奶，食品餡料中的回收率為85.1%～95.4%；相對標準偏差為3.6%～10.9%。

關鍵詞 高效液相色譜法； 對羥基苯甲酸酯； 固相萃取； 食品

1 引 言

對羥基苯甲酸酯為常用防腐劑之一，其抑菌范圍廣、作用強、用量少、毒性低、易配伍且防腐效果不易隨pH值的變化而變化，在堿性環境下尚有效\\，對食品起到保鮮與防腐作用。近年來，對羥基苯甲酸酯類防腐劑被廣泛應用于各種食品中，但是大量或不當使用防腐劑會對人體造成一定損害，如有雌激素樣作用，影響人的內分泌功能等\\。因此，中國、加拿大、日本和歐盟等許多國家和國際組織對食品中對羥基苯甲酸酯類防腐劑的使用制定了添加限量\\。

目前，對羥基苯甲酸酯的測定方法主要有高效液相色譜法\\、薄層色譜法\\、氣相色譜法\\ 、氣相色譜質譜法\\和毛細管電泳法\\等。王萍亞等\\用高效液相色譜法測定腌菜中6種對羥基苯甲酸酯； 迪麗努爾·馬力克等\\用氣相色譜法測定液狀食品中4種對羥基苯甲酸酯等。這些文獻方法多是對一類樣品基質中的幾種對羥基苯甲酸酯的含量進行測定，適用范圍較窄。本研究建立了同時測定蔬菜、水果（經表面處理）、碳酸飲料、牛奶、醋、食品餡料等食品中6種對羥基苯甲酸酯的高效液相色譜二極管陣列檢測器的分析方法。與已報道的文獻方法相比，本方法的檢出限更低，線性范圍更寬，適用于同時測定各種食品基質中6種對羥基苯甲酸酯的含量。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200高效液相色譜儀（DAD檢測器，美國Agilent公司）；4011 Digital旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；XHB型振蕩器（江蘇康健醫療用品有限公司）；330K臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；LCC18固相萃取小柱（美國SUPELCO公司）。對羥基苯甲酸（甲、乙、異丙、丙、異丁、丁）酯標準品（純度≥99.5%，奪Dr. Ehrenstorfer GmbH）；乙腈、甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；其它試劑均為分析純；實驗用水均為二次蒸餾水。

2.2 樣品的提取

稱取5.0 g樣品于50 mL 離心管中，加入2 mL 2 mol/L乙酸銨緩沖液（pH＝6.5）振蕩溶解，加入2 g NaCl，15 mL 乙腈振蕩提取，再加入10 mL 乙腈振蕩提取兩次，合并提取液于旋蒸瓶中，旋轉蒸發至近干，待凈化。

2.3 樣品的凈化

用2 mL 35%甲醇溶解上述步驟處理的殘渣，并轉入已用5 mL甲醇，5 mL水活化的LCC18固相萃取小柱，用3 mL 30%甲醇淋洗，5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，置于40 ℃氮吹儀上濃縮至干，殘渣用2 mL甲醇溶解振蕩2 min，過0.45

3 結果與討論

3.1 色譜條件選擇

在參照文獻\\的基礎上選擇甲醇和水為流動相，等度洗脫始終不能將對羥基苯甲酸丙酯和異丙酯、丁酯和異丁酯有效分離；因此，對梯度洗脫程序進行優化，在2.4節的色譜條件下，6種對羥基苯甲酸酯得到有效分離，且靈敏度較高。6種對羥基苯甲酸酯標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 6種對羥基苯甲酸酯標準溶液色譜圖

Fig．1 Chromatogram of 6 kinds of 4hydrobenzoic acid ester standardsolution

標準溶液濃度為 5.0 mg/L，1. 對羥基苯甲酸甲酯; 2. 對羥基苯甲酸乙酯; 3. 對羥基苯甲酸異丙酯; 4. 對羥基苯甲酸丙酯; 5. 對羥基苯甲酸異丁酯; 6. 對羥基苯甲酸丁酯。

Concentration of standardsolution was 5.0 mg/L， 1. 4hydrobenzoic acid methyl ester; 2. 4hydrobenzoic acid ethyl ester; 3. 4hydrobenzoic acid isopropyl ester; 4. 4hydrobenzoic acid propyl ester; 5. 4hydrobenzoic acid isobutyl ester; 6. 4hydrobenzoic acid butyl ester.

3.2 提取溶劑的選擇

對羥基苯甲酸酯難溶或微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈等有機溶劑\\。本研究對上述幾種溶劑的提取效率進行了考察。結果表明，甲醇、乙醇、丙酮、甲醇乙腈（1∶1， V/V）對部分基質的提取效率不高，且提取溶液渾濁，旋蒸過程中易鼓泡，不易操作；乙醚、乙腈對食品中6種對羥基苯甲酸酯的提取效率高，提取溶液清澈，易進行固相萃取凈化。國家標準GB/T 5009.312003 \\采用乙醚提取，乙醚沸點低，揮發性強，易燃易爆，且產生大量有機廢液，為了能同時預處理多種類的樣品基質，并可同時檢測6種對羥基苯甲酸酯，本研究選擇了干擾較少，回收率和選擇性都滿足要求的乙腈作為提取溶劑。

3.3 凈化方法的選擇

3.3.1 固相萃取小柱（SPE）的選擇 食品種類繁多，含有大量不確定干擾物，進樣前需對樣品進行有效凈化。國家標準GB/T 5009.312003 \\采用液液萃取對食品中2種對羥基苯甲酸酯進行凈化，操作繁瑣，產生大量有機廢液。固相萃取凈化技術能有效分離目標化合物與基體干擾物，且分析時間短，溶劑使用量少，操作簡便。本研究對HLB\\ 和LCC18\\固相萃取小柱（SPE）進行了優化選擇。結果表明，LCC18柱對樣品中6種對羥基苯甲酸酯有較好保留，回收率高。因此，選擇LCC18柱對樣品進行凈化。

3.3.2 淋洗液的選擇

樣品上柱后，有些干擾物質會與被測物一起被吸附，有必要在洗脫被測物前，先淋洗萃取柱去除雜質。在空白樣品基質中添加1.0 mg/kg對羥基苯甲酸酯標準溶液，經乙腈提取濃縮后上LCC18固相萃取柱，以不同濃度的甲醇作為淋洗液，考察其回收率，結果見表1。結果表明，采用30%甲醇淋洗液，既能有效去除干擾雜質，又不會將目標化合物洗脫，不同淋洗液的液相色譜圖見圖2。因此，選擇30%甲醇作為淋洗液。

3.3.3 洗脫液的選擇 對不同濃度的氨化甲醇洗脫效果進行了考察，洗脫能力隨氨水濃度增大而增強，干擾成分也會增加。從表2可見：用5%氨化甲醇洗脫時，6種對羥基苯甲酸酯均被洗下，回收率均較高，且干擾成分少。因此，選擇5%的氨化甲醇為洗脫液。