大豆Em(LEA1)蛋白保守結構域的結構和聚集特性

摘 要 采用圓二色譜（CD）和核磁共振波譜（NMR）方法研究了大豆Em（LEA1）蛋白保守基序EmC和Em2M多肽在不同環境中的結構及聚集行為。研究表明，在水和DMPG溶液中，兩種多肽主要以無規結構形式存在。在50% TFE 溶液中，EmC多肽折疊結構增加，含疏水殘基的部分區域可能形成α螺旋結構，且分子以二聚體形式存在；而Em2M則以單體形式存在，且有序結構較少。以上結果表明，環境變化可能導致兩種多肽的空間結構和聚集行為改變，這有助于理解Em蛋白在不同環境中的結構特點，及其重要區域在全長蛋白中所起的作用。

關鍵詞 晚期胚胎發生富集（LEA1）蛋白； 核磁共振； 結構； 聚集

1 引 言

晚期胚胎發生富集（Late embryogenesis abundant，LEA）蛋白是一類與植物抗逆反應相關的重要蛋白質。根據其表達模式和序列特點，可將其分為7組\\。其中第一組LEA蛋白（簡稱為LEA1）全長序列高度保守，富含甘氨酸和帶電氨基酸，且在氨基端、中部和羧基端分別存在不同20氨基酸基序\\。LEA1蛋白主要存在于植物界中，在一些細菌和甲殼綱動物，如豐年蝦等生物體中也發現了此類蛋白\\。已有研究表明，小麥PM1959、大豆Em和小麥TaEm蛋白（LEA1）的表達可以提高多種生物（如轉基因植物、酵母和大腸桿菌重組子）對干旱、高鹽和滲透等脅迫的耐受性\\。體外實驗證明，小麥Em和大豆Em等（LEA1）可保護乳酸脫氫酶（LDH）或檸檬酸合成酶免于因高溫、干燥和冰凍脅迫所引起的酶活性喪失\\，LEA1蛋白可能具有多重保護功能。因此，揭示LEA1蛋白的保護功能，理解其作用機理，可為有效利用LEA基因，培育抗逆植物新品種提供重要的基礎資料。

在天然狀態下，LEA蛋白為無規結構蛋白\\。Tunnacliffe等\\指出，LEA蛋白結構的可塑性可能是實現多功能的重要基礎。在水溶液中， LEA1蛋白多以自由卷曲和少量α螺旋結構存在。當遇干燥脅迫或在醇溶液中，LEA1蛋白的α螺旋含量增多，預示著LEA1蛋白的α螺旋結構將參與對細胞的保護作用\\。小麥Em蛋白（LEA1）N端的α螺旋結構對經干燥脅迫的酶活性的保護作用是必需的\\。因此，研究LEA1蛋白和其重要結構域的結構及其隨環境的變化，有助于揭示在各種環境脅迫下LEA1蛋白與其它分子間可能發生的相互作用，及保護生物大分子等過程。

大豆Em蛋白屬LEA1蛋白，可編碼105個氨基酸，其中的第44～63位氨基酸為保守的中部20氨基酸基序（EmM區），該基序前面有43個氨基酸片段（EmN區），基序后面有42個氨基酸片段（EmC區）。本課題組最近報告，大豆Em蛋白全長蛋白、EmC、Em2M（含2個M區）和EmN片段的表達均可賦予重組大腸桿菌對高鹽的耐受性，而且還可以通過穩定LDH酶蛋白結構、阻止其聚集而保護凍融脅迫下的LDH酶活性\\。

為了認識Em蛋白和其保守結構域的結構，及其隨環境變化的特點，并為進一步理解其重要區域在全長蛋白中所起的作用提供有用的結構信息，本研究采用圓二色譜（CD）和核磁共振波譜（NMR）方法研究了EmC和Em2M多肽在水、50% TFE溶液和陰性脂質體（DMPG）等不同環境下的結構和聚集行為。2 實驗部分

2.1 材料

多肽EmC和Em2M（表1）的表達、純化及鑒定參見文獻 \\。氘代三氟乙醇（TFEd2；98%，Cambridge Isotope Laboratories公司）；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG，Avanti Polar Lipids Inc公司）；氯仿和甲醇（東莞市東江化學試劑有限公司）。

表1 多肽氨基酸序列（50個氨基酸）

Table 1 Sequence of peptides （50 amino acid）

M domain of soybean LEAI protein Em （Em2M）GSHMASGGQTRKEQLGTEGYQEMGRKTSGGQTRKEQLGTEGYQEMGRKTSC domain of soybean LEAI protein Em （EmC）GSHMASGGLSTVDKSGEERAQEEGIGIDESKFRTGNNKNQNQNEDQDKTS

2.2 分析方法

2.2.1 遠紫外圓二色譜（FarUV CD） （1）樣品制備 A. 水溶液中樣品：將適量肽直接溶于20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中，使肽的終濃度為7

mol/L，磷脂與肽的濃度比為100∶1，混合溶液在35 ℃水浴中超聲1 h。（2） 儀器 Jasco J815圓二色譜儀。石英比色皿光程為0.1 cm，波長范圍190～250 nm；帶寬1.0 nm；所有實驗均在20 ℃進行。每個樣品掃描2次，每張譜圖取2次的平均值。所有肽膜體系的譜圖均為經過扣除單獨的磷脂膜（背底）后的結果，以平均殘基摩爾橢偏率θ表示：

θ＝θobs10lcn（1）

θobs是實驗所測的橢偏率（mdeg），l是石英比色皿的路徑長度（cm），c是肽的濃度（mol/L），n是多肽所含氨基酸個數。

蛋白質二級結構是通過CDPro軟件進行分析得到的。軟件由3個常用的程序SELCON3， CDSSTR和CONTIN組成。以48個參考蛋白對CD譜進行分析，并取3種程序計算結果的平均值。

2.2.2 核磁共振波譜 樣品制備：將適量的EmC和Em2M多肽分別溶于50% TFEd2溶液，使多肽的終濃度為2.88 mmol/L。

用于結構測定的核磁實驗均在布魯克AVANCE 600 MHz核磁共振波譜儀上完成，探頭為配備了X， Y， Z梯度線圈的5 mm三共振反式探頭。選用TSPd4作為內標。實驗溫度為298 K，所有二維1H譜均采用了壓水峰技術。TOCSY和NOESY實驗采用儀器自帶的標準脈沖序列進行采樣，混合時間分別為100和200 ms。采樣數據矩陣2048

512，累加96～168次。采用標準Bruker軟件（XWINNMR 3.5版本）進行譜圖處理，處理后的譜圖用SPARKY軟件進行分析。

 

擴散排序（DOSY）核磁共振實驗在配備有Z軸梯度場的三共振反向檢測探頭的布魯克AVANCE 500MHz核磁共振波譜儀上完成，實驗溫度為298 K。肽擴散系數的測定采用了含有WATERGATE壓水峰技術的BPPSTE（Bipolar Pulse Pair Stimulated Echo）脈沖序列。水或TFE擴散系數的測定采用不含壓水峰技術的STE（Stimulated Echo）脈沖序列。