基于脈動變光程的分光光度法自標定檢測磷酸鹽

摘 要 分光光度法應用于磷酸鹽長期監測存在絡合物對透光窗口附著污染的干擾問題。本研究采用新的脈動變光程的分光光度檢測原理， 提出自標定檢測方法， 開發了脈動可變光程的機械裝置。利用此設備實現了水體磷酸鹽檢測的長期原位自標定。利用本方法與傳統分光光度計進行長期監測對比實驗， 結果表明：本方法能夠有效去除鏡頭附著污染等干擾因素影響， 提高了檢測結果的準確性與可靠性。

關鍵詞 分光光度法； 磷酸鹽； 脈動變光程

1 引 言

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磷是生物能量傳輸和動植物、浮游生物生長必需的營養要素， 水體中的氮和磷的濃度及其比值顯著影響浮游植物的豐度及種類。磷的生物可利用性可能直接影響到全球海洋初級生產力水平\\。因此， 磷酸鹽含量是生物地球化學過程的關鍵參數， 而活性磷酸鹽是研究磷在水體中循環的最關鍵參數。

目前， 實驗室的活性磷酸鹽檢測方法主要有磷鉬黃分光光度法、磷鉬藍（Phosphomolybdenum blue， PMB）分光光度法及流動注射分光光度法等\\。由于在磷酸鹽長期在線監測過程中， 有色絡合物會累積附著在透光窗口上， 導致測量得到的透射光強度減弱， 從而使檢測結果偏離標定曲線， 產生檢測誤差。克服有色絡合物附著污染的有效方法是對儀器進行定期標定。但長期在線標定存在以下的問題：（1）現場環境一般難以在線標定， 并且標準溶液也難以在線長期保存；（2）標定只能保障特定時刻數據檢測的準確性， 而無法保障介于兩次標定之間的檢測數據的準確性。已有研究者基于改進試劑的保存狀態和條件， 解決了傳統分光光度法所需的試劑保存有效期較短的問題\\， 但是并沒有解決絡合物附著污染帶來的干擾問題。有研究者提出在數據處理中對監測數據進行線性補償的方式， 去除在長期監測中因有色絡合物污染透光窗口導致光強減弱的干擾\\。但是這種方法只對特定場所的勻速漸變附著有效， 而現場絡合物附著往往是階段性突變過程， 所以該補償方法不具有通用性。再者， 絡合物在透光窗口沉積與磷酸鹽樣品濃度及檢測頻率有關。因此， 該線性補償的方法并不能實質解決干擾問題。

針對活性磷酸鹽長期原位監測問題的瓶頸， 本研究提出一種新的方法——脈動變光程檢測， 即將分光光度檢測的光程分為多等分的脈動量， 當檢測光程變化一個或多個脈動量時， 檢測裝置動態記錄測量的吸光量。該原理引入一個穩定的檢測光程變化量ΔL， 而測量的吸光量的變化量僅與ΔL、待測物濃度與吸光常數相關。因此， 其它干擾因素， 如光源漂移、有色絡合物附著等， 則可視為不變量被除去。2 檢測原理

如果在較短時間內， 改變檢測光通過待測物的吸光光程（L）， 也就是恒壓改變檢測容腔的容積， 而保持待測物溫度、壓力、濃度（c）等不變， 由于絡合物附著擾動是一個相對長期緩慢變化過程， 因此在前后相鄰的檢測過程中可視為不變量。則脈動變光程后待測物的光程變化了ΔL。根據朗伯比爾定律， 上述過程可表示為：

I2＝I0·e

3 實驗部分

3.1 儀器與試劑

CHEM4VISFIBER分光光度計（Ocean optics）；脈動變光程分光光度系統（自制， 圖1）。CHEM4VISFIBER分光光度計覆蓋430～990 nm的光譜范圍， 光學分辨率為1.0 nm， 通過RS232串行接口可將光強數據發送給數據接收端。CHEM4VISFIBER通過準直鏡和光纖， 可以實現將其光源和探測器應用于脈動變光程分光光度系統。

6.0 mol/L H2SO4（分析純）；鉬酸銨溶液：溶解28 g鉬酸銨（分析純）于200 mL水中；酒石酸銻鉀溶液：溶解6 g酒石酸銻鉀（分析純）于200 mL水中， 貯于聚乙烯瓶中；混合溶液：邊攪拌邊將45 mL鉬酸銨溶液加到200 mL 6.0 mol/L H2SO4中， 加入5 mL酒石酸銻鉀溶液， 混勻， 貯于棕色玻璃瓶中；抗壞血酸溶液：溶解20 g抗壞血酸（分析純）于200 mL水中， 盛于棕色聚乙烯瓶中；磷酸鹽標準貯備溶液（0.300 g/L P）：稱取1.318 g6.0 mol/L KH2PO4（優級純）溶于10 mL 6.0 mol/L H2SO4及少量水中， 全量轉入1000 mL量瓶， 定容， 混勻， 再加1 mL三氯甲烷（分析純）；磷酸鹽標準使用溶液（3.00 mg/L P）：量取1.00 mL磷酸鹽標準貯備溶液至100 mL量瓶中， 定容， 混勻， 加兩滴三氯甲烷。

3.2 脈動變光程分光光度系統

脈動變光程（PVOPL）分光光度系統主要由注射泵、多通閥、反應池、廢液袋和脈動變光程裝置組成， 如圖1所示。系統通過注射泵和多位閥配合完成試樣的引入、預處理、反應和檢測等， 采用自制的脈動變光程裝置， 利用CHEM4VISFIBER分光光度計的光源和檢測器， 完成濃度的檢測。

如圖1B所示， CHEM4VISFIBER分光光度計的光源和檢測器分別通過光纖經過中空管8、9連接至準直鏡14、15。光線依次經過有機玻璃窗10、待測液腔3、有機玻璃5、空白液腔4和有機玻璃窗11組成的光程固定的光程池（設計長度300 mm）。有機玻璃5和有機玻璃窗10之間為待測液腔， 有機玻璃5

和有機玻璃窗11之間為空白液腔。步進電機轉動時， 通過絲桿螺紋帶動固定有有機玻璃5的套筒移

圖1 脈動變光程分光光度系統

Fig．1 Pulsating variable optical path length （PVOPL） spectrophotometric system

A: S. 樣品（Sample）；R. 試劑（Reagent）；SV. 多位選擇閥（Multiposition valve）；SP. 注射泵（Syring pump）；RC. 反應池（Reactor Cell）；W. 廢液（Waste）; B: LS. 光源（Light source）；D. 檢測器（Detector）；1，2. 待測/空白液出入口（Sample/Blank inlet/Outlet）；3，4. 待測/空白液腔（Sample/Blank cell）；5. 有機玻璃（Organic glass）；6. 步進電機（Stepper motor）；7. 絲桿（Screw rod）；8，9. 中空柱塞（Hollow plunger）；10，11. 有機玻璃窗（Organic glass window）；12，13. 密封圈（ORing）； 14，15. 準直鏡（Collimator）。

動， 改變待測液腔3和空白液腔4的大小， 從而改變待測液光程。步進電機的動作通過微控制器控制?？刂栖浖⒐獬坛胤譃?0等分， 最小光程差為30 mm。

3.3 檢測方法和步驟

3.3.1 磷鉬藍分光光度法 在酸性介質中， 活性磷酸鹽與鉬酸銨反應生成磷鉬黃， 用抗壞血酸還原為磷鉬藍后， 于882 nm波長測定吸光值。首先將SV1連通①③， 由注射泵吸入試劑， 再將SV1連通①④， 由注射泵將試劑注入反應池。然后將SV1連通①②， 由注射泵吸入待測液， 再將SV1連通①④， 將待測液注入反應池， 充分反應后， 將SV2連通①③， 利用脈動變光程裝置進行檢測。檢測完畢后， 將SV2連通②③， 脈動變光程裝置將液體排出到廢液袋中。

3.3.2 繪制標定曲線 量取0， 1.00， 1.50， 2.00， 2.50， 3.00和3.50 mL磷酸鹽標準溶液于50 mL帶刻度具塞比色管中， 定容得到7個濃度梯度的磷酸鹽標準液。上述溶液各加1.0 mL混合溶液， 1.0 mL抗壞血酸溶液， 混勻。顯色5 min后， 利用脈動變光程裝置進行測量， 空白溶液為蒸餾水?？刂撇竭M電機， 在某一濃度下， 測量光程在L0處的吸光值A0和光程在L1處的吸光值A