離子色譜法測(cè)定大腸癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖

摘 要 建立了大腸癌患者尿液中甘露醇和乳果糖的高效陰離子交換分離脈沖積分安培（HPAECPAD）檢測(cè)方法。樣品經(jīng)稀釋、凈化、過濾后進(jìn)行色譜分析， 采用Carbopac PA1（250 mm×4 mm）陰離子交換柱分離， 以NaOH乙酸鈉梯度淋洗液為流動(dòng)相， 流速1.0 mL/min， 脈沖積分安培檢測(cè)器（PAD）檢測(cè)， 外標(biāo)法定量。結(jié)果表明， 甘露醇和乳果糖的的線性范圍為0.2～20 mg/L， 相關(guān)系數(shù)分別為0.9995和0.9998， 回收率為91.7%～102.6%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.1%， 檢出限為0.05和0.06 mg/L（S/N＝3）。本方法前處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好， 可用于大腸癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 離子交換色譜； 甘露醇； 乳果糖； 尿液

1 引 言

乳果糖和甘露醇均為不被人體代謝的糖類， 在正常情況下， 不易被腸道吸收， 在尿中含量很少。在病理情況下， 腸粘膜受損， 細(xì)胞間的緊密連接被破壞， 細(xì)胞間隙擴(kuò)大， 通透性增加， 通過細(xì)胞旁通道吸收的乳果糖（Latulose， L）量明顯增加。而穿過小腸上皮細(xì)胞水溶性微孔吸收的甘露醇（Mannitol， M）的吸收量變化甚微， L與M的比值L/M增大。L/M可排除胃排空時(shí)間、心輸出量、腎排出量及尿液收集等誤差對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響， 能真實(shí)地反映腸粘膜屏障通透性變化情況。腸通透性是評(píng)價(jià)腸屏障功能的重要指標(biāo)。

高效陰離子交換脈沖積分安培分離檢測(cè)方法（HPAECIPAD）目前已被廣泛應(yīng)用于各種糖的分析測(cè)定。本方法主要依據(jù)糖類在堿性溶液中可呈現(xiàn)離子化狀態(tài)， 不同糖類的離子化程度不同， 即pKa不同， 根據(jù)糖類pKa的差異以及某些糖類與陰離子交換樹脂之間的疏水性相互作用而在離子交換色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離。同時(shí)， 糖類的羥基在堿性溶液中具有電化學(xué)活性， 在外加電壓作用下， 羥基易在金電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)， 根據(jù)羥基在金電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電量大小實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該方法具有無(wú)需衍生、操作方便、靈敏度高、不使用有毒化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)， 對(duì)糖類的檢出限可以達(dá)到pmol級(jí)\\。

目前， 尿液中甘露醇和乳果糖的測(cè)定主要采用氣相色譜法\\及高壓液相色譜儀\\， 常用檢測(cè)器是ELSD、MS和 RID， 但它們都存在前處理繁瑣、操作復(fù)雜或重復(fù)性不佳等缺點(diǎn)， 特別是靈敏度低， 達(dá)不到檢測(cè)要求， 且容易受到復(fù)雜基體的干擾。

離子色譜安培檢測(cè)分離度好、靈敏度高， 比UVELSD和UVRID法優(yōu)勢(shì)明顯。于博昊等\\采用離子色譜的方法曾對(duì)幼兔尿樣中的甘露醇和乳果糖進(jìn)行定性與定量檢測(cè)， 結(jié)果表明， 離子色譜法能有效檢測(cè)甘露醇和乳果糖， 且方便快捷， 具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。馮蕾等\\建立了固相萃取高效陰離子交換色譜積分脈沖安培法測(cè)定癌癥患者尿液中異黃蝶呤的分析方法， 能去除大量干擾物質(zhì)， 具有靈敏度高、選擇性好、對(duì)環(huán)境造成的二次污染小等特點(diǎn)。

本研究采用高效陰離子交換脈沖積分安培法分離人體尿液中甘露醇和乳果糖， 并應(yīng)用于大腸癌患者尿液的實(shí)際樣品測(cè)試。

20 ℃的冰箱保存。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取標(biāo)樣， 用含20 mg/L NaN3超純水制1000 mg/L的甘露醇和乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液， 保存于冰箱冷藏室中。臨用時(shí)稀釋成100 mg/L， 分別準(zhǔn)確移取適量的100 mg/L甘露醇和乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中， 用水定容， 配制成0， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0和20.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

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2.2.3 供試溶液的配制 抽取尿液樣品， 以10000 r/min離心10 min， 分別準(zhǔn)確移取上清液1.0 mL， 置于100 mL容量瓶中， 以水定容。