離子色譜法測定大腸癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖

摘 要 建立了大腸癌患者尿液中甘露醇和乳果糖的高效陰離子交換分離脈沖積分安培（HPAECPAD）檢測方法。樣品經稀釋、凈化、過濾后進行色譜分析， 采用Carbopac PA1（250 mm×4 mm）陰離子交換柱分離， 以NaOH乙酸鈉梯度淋洗液為流動相， 流速1.0 mL/min， 脈沖積分安培檢測器（PAD）檢測， 外標法定量。結果表明， 甘露醇和乳果糖的的線性范圍為0.2～20 mg/L， 相關系數分別為0.9995和0.9998， 回收率為91.7%～102.6%， 相對標準偏差均小于2.1%， 檢出限為0.05和0.06 mg/L（S/N＝3）。本方法前處理簡便、靈敏度高、重現性好， 可用于大腸癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖的測定。

關鍵詞 離子交換色譜； 甘露醇； 乳果糖； 尿液

1 引 言

乳果糖和甘露醇均為不被人體代謝的糖類， 在正常情況下， 不易被腸道吸收， 在尿中含量很少。在病理情況下， 腸粘膜受損， 細胞間的緊密連接被破壞， 細胞間隙擴大， 通透性增加， 通過細胞旁通道吸收的乳果糖（Latulose， L）量明顯增加。而穿過小腸上皮細胞水溶性微孔吸收的甘露醇（Mannitol， M）的吸收量變化甚微， L與M的比值L/M增大。L/M可排除胃排空時間、心輸出量、腎排出量及尿液收集等誤差對檢測結果的影響， 能真實地反映腸粘膜屏障通透性變化情況。腸通透性是評價腸屏障功能的重要指標。

高效陰離子交換脈沖積分安培分離檢測方法（HPAECIPAD）目前已被廣泛應用于各種糖的分析測定。本方法主要依據糖類在堿性溶液中可呈現離子化狀態， 不同糖類的離子化程度不同， 即pKa不同， 根據糖類pKa的差異以及某些糖類與陰離子交換樹脂之間的疏水性相互作用而在離子交換色譜柱上實現分離。同時， 糖類的羥基在堿性溶液中具有電化學活性， 在外加電壓作用下， 羥基易在金電極表面發生氧化還原反應， 根據羥基在金電極表面發生氧化反應產生的電量大小實現檢測。該方法具有無需衍生、操作方便、靈敏度高、不使用有毒化學試劑和有機溶劑的優點， 對糖類的檢出限可以達到pmol級\\。

目前， 尿液中甘露醇和乳果糖的測定主要采用氣相色譜法\\及高壓液相色譜儀\\， 常用檢測器是ELSD、MS和 RID， 但它們都存在前處理繁瑣、操作復雜或重復性不佳等缺點， 特別是靈敏度低， 達不到檢測要求， 且容易受到復雜基體的干擾。

離子色譜安培檢測分離度好、靈敏度高， 比UVELSD和UVRID法優勢明顯。于博昊等\\采用離子色譜的方法曾對幼兔尿樣中的甘露醇和乳果糖進行定性與定量檢測， 結果表明， 離子色譜法能有效檢測甘露醇和乳果糖， 且方便快捷， 具有良好的穩定性和重復性。馮蕾等\\建立了固相萃取高效陰離子交換色譜積分脈沖安培法測定癌癥患者尿液中異黃蝶呤的分析方法， 能去除大量干擾物質， 具有靈敏度高、選擇性好、對環境造成的二次污染小等特點。

本研究采用高效陰離子交換脈沖積分安培法分離人體尿液中甘露醇和乳果糖， 并應用于大腸癌患者尿液的實際樣品測試。

20 ℃的冰箱保存。

2.2.2 標準溶液的配制 稱取標樣， 用含20 mg/L NaN3超純水制1000 mg/L的甘露醇和乳果糖標準溶液， 保存于冰箱冷藏室中。臨用時稀釋成100 mg/L， 分別準確移取適量的100 mg/L甘露醇和乳果糖標準溶液于100 mL容量瓶中， 用水定容， 配制成0， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0和20.0 mg/L的系列標準工作溶液。

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2.2.3 供試溶液的配制 抽取尿液樣品， 以10000 r/min離心10 min， 分別準確移取上清液1.0 mL， 置于100 mL容量瓶中， 以水定容。