適配體生物傳感器在病原微生物檢測中的應用

摘 要 適配體是通過指數富集系統進化技術（SELEX）體外篩選得到的一類能夠特異性地結合小分子物質、蛋白， 甚至整個細胞的寡核苷酸序列。由于具有制備簡便、易于修飾、穩定性好等特點， 適配體已廣泛應用于構建生物傳感器， 實現對病原微生物的識別和檢測。本文在闡述適配體基本原理的基礎之上， 結合近年來病原微生物適配體研究領域的最新研究成果， 綜述以病原微生物為目標的適配體篩選技術的最新進展；列舉目前已經篩選獲得的病原微生物（原生生物、病毒、細菌）適配體；綜述適配體生物傳感器在病原微生物檢測中的應用。并展望了適配體生物傳感器在病原微生物檢測領域的發展趨勢。

關鍵詞 適配體； 病原微生物； 檢測； 生物傳感器； 評述

1 引 言

病原微生物是一類引起人類與動植物各種疾病的微生物， 包括原生生物、病毒和細菌。常見的病原微生物有瘧原蟲、人類免疫缺陷病毒、大腸埃希氏桿菌、傷寒沙門氏菌等。每年它們給人類和各種動植物的健康造成了極大的危害， 帶來了巨大的經濟損失\\。因此， 迫切需要研發快速、靈敏和低成本的檢測方法， 以監測和控制它們在食品和環境中的傳播。傳統的病原微生物檢測方法首先通過分離培養， 然后進行一系列復雜繁瑣的生化測試檢測樣品中的微生物\\。這種檢測方式雖然具有很高的靈敏度和特異性， 但是需要的時間較長（通常需要5～7 d）， 因而不適用于快速現場檢測。近年來， 生物傳感器由于具有快速、靈敏、特異性高、成本低的優點， 而被廣泛運用于病原微生物的檢測\\。生物傳感器是利用分子識別元件和待測病原微生物的特異性結合產生的生物學信息， 通過轉換器轉化為電、光等物理信號輸出， 從而達到分析檢測的目的\\。常見的分子識別元件為抗體， 抗體具有高親和性、高特異性， 基于抗體的生物傳感器目前已被廣泛的研發。但是抗體具有一些自身的局限性， 如針對某種目標物的抗體需要一系列繁瑣復雜的體內篩選過程， 因而實驗周期長， 成本高， 同時抗體容易變性， 對檢測環境的要求較高\\。因此， 需要研發一種新的分子識別元件， 不僅具有抗體的高特異性， 同時又能克服抗體存在的缺點， 應用于病原微生物檢測。

適配體是一類在體外篩選的， 能與相應目標物專一并緊密結合的一類單鏈寡核苷酸序列\\。在生物傳感器的構建方面， 適配體具有一些優于抗體的優點：（1）適配體是通過體外篩選， 適配體SELEX篩選周期一般為2～3個月， 最快的只需2周， 而制備單克隆抗體則至少需要3～6個月， 且成本昂貴；（2）適配體是通過化學法合成的， 因而可以在適配體上靈活修飾多種基團， 使其具有多種功能；（3）抗體的蛋白本質決定了它容易變性， 傳統免疫生物傳感器化學和物理性質的不穩定限制了生物傳感器的應用范圍， 而適配體具有化學穩定性， 在pH 2～12的寬范圍內保持穩定， 并具有一定的熱復性；（4）適配體組成簡單， 一般由幾十個核苷酸（少于100 nt）組成， 因而適配體的設計相對簡單。由于適配體擁有抗體無法比擬的優勢， 利用適配體設計生物傳感器對病原微生物進行識別和檢測， 具有極其重要的意義\\。

2 病原微生物核酸適配體的SELEX篩選方法

SELEX技術是篩選特異性適配體的通用過程， 主要有5步（圖1）：結合、分離、洗脫、擴增和調節。首先將包含有1013～1015個隨機序列的核苷酸序列庫（ssDNA文庫、RNA文庫）與靶分子混合溫育， 隨后通過物理方法分離出結合了靶分子的核苷酸序列。洗脫收集獲得結合序列， 并將結合序列進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增生成次級文庫， 用于下輪篩選。一般通過6～20輪SELEX循環， 對已達到高親和力的擴增產物進行克隆測序， 從而獲得特異性識別靶分子的適配體\\。對于篩選病原微生物適配體的SELEX過程， 最關鍵的兩個步驟為篩選適配體靶分子的選擇和結合序列的分離。

圖1 SELEX 技術流程圖\\

Fig．1 Schematic of systematic evolution of exponential enrichment （SELEX） technique\\

2.1 篩選適配體的靶分子

病原微生物為生物大分子， 具有復雜的靶結構。篩選適配體的靶分子常為病原微生物細胞表面某個特定純化蛋白\\、病原微生物細胞的裂解物\\或者是完整的細胞\\。

目前， 大部分適配體的篩選是選擇純化的可溶性蛋白作為靶分子。這是因為純化的蛋白成分單一， 能夠保證每個循環中與核酸結合的蛋白結構的穩定性， 提高SELEX篩選的效率\\。但是， 使用純化蛋白作為靶分子也存在一些缺點。首先， 被篩選的純化蛋白分子不能保持其在完整細胞中的天然構象， 從而引起篩選出來的適配體與完整細胞的結合力減弱；其次， 有些純的靶蛋白不易獲得， 特別是當篩選的目標物未知時， 以純化的某種特定蛋白作為靶分子篩選適配體會更加困難。

研究構成復雜的病原微生物需要一種針對復合靶的篩選方法。微生物適配體篩選多采用完整的細胞作為復合靶分子， 但這種復合靶分子通常會帶來靶分子位點多、不易篩選出高特異性核酸適配體的問題。為了解決該問題， 通常使用兩種或多種同源微生物， 用于反向、消減篩選步驟， 以得到針對目標微生物的具有高特異性的適配體\\。Cao等以完整的金黃色葡萄球菌作為靶分子進行篩選， 為了提高篩選適配體的特異性， 而使用鏈球菌和表皮葡萄球菌進行消減篩選。經過多輪篩選， 得到11條對金黃色葡萄球菌具有特異性的適配體， 并且證明多條適配體聯合使用比單一的適配體對金黃色葡萄球菌的特異性更高\\。

2.2 結合序列的分離

有效去除未結合的寡核苷酸是適配體篩選過程中的關鍵步驟之一， 對篩選適配體的結合特性有極大影響。良好的分離方法可以有效減少篩選的循環次數， 提高篩選適配體的特異性和親和性。由于靶分子為蛋白或完整細胞， 屬于生物大分子， 常用的分離結合序列的方法有過濾法\\、離心法\\、磁珠分離法。以上幾種方法雖然可以將病原微生物結合復合物與未結合核苷酸序列分離， 但是分離的同時不能得到病原微生物與核苷酸序列的親和信息， 而需要后續繁瑣的測試過程。目前， 一些新的分離技術， 如毛細管電泳技術\\、表面等離子共振\\、流式細胞術等， 已逐步用于分離病原微生物結合復合物與未結合核苷酸序列， 這些方法在實現分離的同時還可以評估微生物與核酸序列的親和性， 使得適配體的篩選過程變得相對簡便。毛細管電泳的原理是基于不同組分間荷質比差異導致的電泳遷移率不同而進行分離。當靶分子與其適配體親和作用足夠強， 形成的復合物足夠穩定時， 在合適的分離和檢測條件下， 可分別得到游離的寡核苷酸與復合物的電泳峰\\。毛細管電泳技術具有分離速度快、分辨率高、操作簡單、樣品用量少和研究成本低等明顯優勢， 在這個領域已顯示出巨大的潛力。此外， 表面等離子共振、流式細胞術等近年來在適配體的篩選分離中也有所應用。這些方法不僅能高效分離結合序列， 更能同時測定篩選出的核苷酸與靶分子的親和能力， 簡化了SELEX的步驟， 在適配體篩選領域具有十分重要的意義。

3 病原微生物的適配體

3.1 原生生物適配體

錐蟲是一類重要的病原微生物， 它可寄生在多種溫血動物和冷血動物中， 給人類和動物的健康造成了極大的危害。最早篩選出的錐蟲適配體是布氏錐蟲適配體。Homann等\\使用布氏錐蟲的完整細胞作為目標靶分子， 篩選出3類共22條不同序列的RNA適配體， 能特異性地識別布氏錐蟲細胞表面的鞭毛蛋白。隨后， Ulrich等\\又篩選出另一種錐蟲——克氏錐蟲的適配體， 獲得4類共23條RNA適配體， 該適配體能特異地與克氏錐蟲表面識別宿主細胞的位點結合。

3.2 病毒適配體

目前， 篩選獲得的病毒適配體主要的是人類免疫缺陷病毒（HIV）\\、肝炎病毒\\、流感病毒\\、非典型性肺炎病毒（SARS）\\的適配體（表1）。人類免疫缺陷病毒屬于慢病毒屬， 是一種潛伏期極長的逆轉錄病毒。針對HIV表面的不同蛋白， 包括結構蛋白RT（p50逆轉錄酶）\\、結構蛋白gp120\\、調控蛋白Tat\\， 分別篩選出3種可以與HIV特異并高親和性結合的適配體。而肝炎病毒是適配體篩選的另一大類病毒， 它是引起病毒性肝炎的病原體。Fukuda和Biroccio分別以丙肝病毒（HCV）的非結構蛋白NS3\\和NS5\\為靶分子， 篩選出針對HCV的適配體。流感病毒是一類容易大范圍流行的病毒。