S,S-氰戊菊酯間接競爭酶聯免疫吸附分析方法研究

摘 要 合成了S，S氰戊菊酯的半抗原S2（4氯苯基）3甲基丁酸αS（N丁酸基）甲酰氨（3苯氧基）芐酯（Efvb）。半抗原通過混合酸酐法與卵清蛋白（OVA）偶聯作為包被抗原，活潑酯法與牛血清蛋白（BSA）偶聯作為免疫抗原。用免疫抗原免疫新西蘭大白兔，得到抗S，S氰戊菊酯多克隆抗體。通過異源分析及檢測條件優化，確立了間接競爭酶聯免疫分析方法的最佳檢測條件為pH 7.4， 0.4 mol/L Na＋、40%甲醇PBS溶液，建立了S，S氰戊菊酯酶聯免疫分析方法。方法的抑制中濃度（IC50）值為（3.16±0.01）mg/L；檢出限（IC10）為（0.0053±0.0012） mg/L。對甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯及其代謝物戊菊酸沒有明顯交叉反應。在自來水、河水和土壤樣品中添加S，S氰戊菊酯，其回收率分別為82.3%～108.2%， 83.1%～109.2%和72.0%～91.2%。

關鍵詞 S，S氰戊菊酯；半抗原；酶聯免疫吸附分析

1 引 言

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S，S氰戊菊酯（Esfenvalerate）是氰戊菊酯的4種立體異構體中活性最高的一種\\，生物活性約為氰戊菊酯的4倍\\。S，S氰戊菊酯對哺乳動物低毒，但對水生生物高毒\\，其廣泛應用于農業生產，進入水環境的途徑也日益增多。因此，建立簡單快速的檢測方法非常必要。我國對S，S氰戊菊酯的殘留檢測以氣相色譜法為主\\，此方法需要精密儀器，不適合大批量樣品的快速測定。酶聯免疫分析方法成本低、速度快，適合大批量樣品的快速分析，可為S，S氰戊菊酯的殘留檢測和監控提供極大的便利。

目前，對立體異構體的免疫分析研究很少，Shan等\\將3\\丙酸芐酯與S戊菊酸聯接，通過酯水解制得半抗原。此方法保留了菊酸部分的一個手性位點，所得的抗體對S，S氰戊菊酯有較高靈敏度。本研究用S，S氰戊菊酯直接水解接臂，制得半抗原，保留了S，S氰戊菊酯的兩個手性位點，通過免疫新西蘭大白兔獲得特異性抗體，經過異源分析及檢測條件優化，建立了S，S氰戊菊酯酶聯免疫分析方法。此抗體對S，S氰戊菊酯立體識別特異性強。在自來水、河水和土壤樣品中添加回收率和相對標準偏差均符合農藥殘留分析要求，可用于水樣和土壤樣品中S，S氰戊菊酯的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

HT5多功能攪拌器（江蘇榮華儀器有限公司）；R200旋轉蒸發儀（瑞士BüCHI公司）；DU800核酸/蛋白分析儀（美國Beckman公司）； LCMSQDECA液質聯用儀（美國Finnigan公司）；DRX 500 核磁共振儀（美國Bruker公司）；Avanti J26XP高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；Professional Meter PP50型pH計（德國Sartorius公司）；Wellwash Plus型洗板機（美國Thermo公司）；iMark酶標儀（美國BioRad公司）。

S，S氰戊菊酯（江蘇皇馬農化有限公司）；氰戊菊酯（南京紅太陽股份有限公司）；S戊菊酸及R戊菊酸（江蘇科達化工有限公司）；4氨基丁酸（國藥集團化學試劑有限公司）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA，上海索萊寶生物科技有限公司）；山羊抗兔IgGHRP（美國Sigma公司）；鄰苯二胺（OPD）及吐溫20（Tween20）（Sigma公司），其它試劑為分析純。半抗原甲氰菊酯氰基水解產物（Fpa）、溴氰菊酯氰基水解產物（Dta）和三氟氯氰菊酯氰基水解產物（Cya），合成方法參考文獻\\。磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）、碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6）、含0.05%吐溫20的PBS溶液（PBST）。實驗動物：雄性新西蘭大白兔。

2.2 實驗方法

2.2.1 半抗原的合成 合成路線如圖解1所示。取5.9 g （14 mmol） S，S氰戊菊酯和3 mL水于150 mL三口瓶中，緩慢滴加8 mL 濃 H2SO4，于90 ℃回流攪拌反應50 min。加入10 mL水，用乙醚萃取兩次，有機相減壓濃縮，得深黃色油狀物。薄層層析純化，展開劑為乙酸乙酯石油醚乙酸（30∶70∶5，V/V），Rf＝0.51的組分用丙酮洗脫濃縮，得黃色的油狀物S2（4氯苯基）3甲基丁酸αS羧基3苯氧基芐酯（Efva），產率約為30%。

稱取2.0 g（4.5 mmol）Efva于100 mL三口燒瓶中，加入5 mL氯化亞砜，在79 ℃回流攪拌反應2.5 h。減壓濃縮，得黃色油狀液體，加入15 mL無水四氫呋喃溶解，于4 ℃下貯存備用。

稱取0.3 g（2.98 mmol）4氨基丁酸于100 mL平底燒瓶中，加入2 mL 2 mo1/L NaOH溶液，在冰浴中攪拌20 min后，加入0.02 g四丁基溴化銨。攪拌下滴加酰氯的四氫呋喃溶液，同時測定體系pH值，滴加NaOH溶液保證反應液pH＞8。在冰浴中繼續攪拌反應4 h。用濃HCl調至pH 2.0，2×30 mL乙酸乙酯萃取，2×10 mL水洗，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，得到黃色的油狀物。薄層層析純化。展開劑為乙酸乙酯石油醚乙酸（28∶67∶5， V/V），Rf＝0.36組分用丙酮洗脫濃縮，得黃色油狀產物S2（4氯苯基）3甲基丁酸αS（N丁酸基）甲酰氨（3苯氧基）芐酯（Efvb），產率約為25%。