高效液相色譜法測定海洋水體與沉積物中光合色素

摘 要 建立了海洋水體與沉積物中30種光合色素的反相高效液相色譜檢測方法。海水濾膜和沉積物分別采用95%甲醇和95%丙酮超聲萃取。萃取液混合一定比例的超純水后，采用Eclipse XDB C8反相柱進行分離，以乙腈（A）、甲醇（B）和四丁基羥胺甲醇（C）混合液為流動相進行洗脫，檢測波長為430， 440和450 nm，柱溫為50 ℃。色譜分離梯度為：0 min， 100% C；22 min，25% A， 45% B和30% C；28～38 min，70% A， 20% B和10% C；38.1～40 min，100% C。對23種已知濃度色素的線性關(guān)系、檢出限和加標回收率進行分析。結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)范圍為0.9972～0.9998，檢出限范圍為0.0305～0.7740 ng，加標回收率范圍為88.6%～103.3%。

關(guān)鍵詞 光合色素； 高效液相色譜； 海水； 沉積物； 海洋微藻

1 引 言

長期以來，海洋微藻分類主要以形態(tài)特征為依據(jù)，依靠專業(yè)人員采用顯微鏡檢測。但這種分析方法具有專業(yè)性要求高，費時費力等缺點；同時許多微型浮游植物缺少明顯的分類學形態(tài)特征，或存在無法固定保存及固定后易變形等問題，容易造成漏檢和誤檢\\。光合色素是藻類重要的生物標記物，不同種類的浮游藻類具有不同的色素組成和特征色素比值，以此為基礎(chǔ)的化學分類方法成為浮游藻類分類學的重要組成部分\\。光合色素種類多達幾百種，建立精確的光合色素定性與定量檢測方法是實現(xiàn)海洋微藻化學分類方法的關(guān)鍵，其中高效液相色譜方法（HPLC）是目前最成功的檢測方法\\。光合色素的HPLC分析在20世紀80年代獲得了快速發(fā)展，實現(xiàn)了葉綠素準確定量分析（不受降解產(chǎn)物影響）\\。隨著HPLC自動化程度的提高，大量現(xiàn)場樣品的光合色素分析成為可能。

1991年， Wright等\\采用C18柱實現(xiàn)了40種類胡蘿卜素和12 種葉綠素及其衍生物的分離。但該方法對一些重要的特征色素，如單乙烯基葉綠素（Chlorophyll a/b）和二乙烯基葉綠素（DV Chlorophyll a/b）， 以及葉綠素c2（Chlorophyll c2） 和c1（Chlorophyll c1）不能進行分離。Zapata等\\采用甲醇、乙腈、丙酮和吡啶的醋酸溶液為流動相，實現(xiàn)了包括葉綠素c類、Chlorophyll a和DV Chlorophyll a等色素的分離，但Chlorophyll b 和DV Chlorophyll b不能分離。van Heukelem等\\僅采用甲醇和水為流動相，并使用四丁基羥胺（TBA）作為修飾劑，改善流動相極性，Chlorophyll a/b和DV Chlorophyll a/b的分離效果良好，但葉綠素c類及胡蘿卜素分離效果欠佳\\。本研究采用C8色譜柱，以甲醇、乙腈和水為流動相，以TBA為修飾劑，建立了藻類光合色素分離新方法，對葉綠素c類、Chlorophyll a和DV Chlorophyll a等色素的分離效果良好。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜系統(tǒng)主要由Agilent1200系列組成，包括以下組件：G1311四元梯度泵，G1311自動進樣器，G1321A熒光檢測器，G1315C二極管陣列檢測器，Eclipse XDB C8反相柱（150 mm×4.6 mm，3.5 m，Aglient Technologies公司）。整套HPLC系統(tǒng)由Agilent ChemStation進行管理。針筒濾器（上海安譜公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；四丁基羥胺（TBA，JT Baker公司）。實驗用水均為經(jīng)Millipore超純水系統(tǒng)生產(chǎn)的超純水。色素標準品（丹麥DHI公司），包括混合色素（含30種組分，未定量）和23種已知濃度的單標色素。

2.2 實驗步驟

2.2.1 樣品采集 于2011年2月在珠江口海域（E113°37′0.0″， N22°6′0.0″）和海南省陵水新村灣（E109°57′44.0″， N18°24′35.0″）采集水樣，于弱光下過濾到47 mm Whatman GF/F 玻璃纖維濾膜上，濾膜于20 ℃下冷凍保存，待分析。

2.2.2 色素提取 濾膜和沉積物色素提取參考文獻\\的方法。將冷凍的濾膜剪碎，置于聚乙烯塑料離心管中，用3 mL 95%（V/V）甲醇提取色素。沉積物于

L。采用二極管陣列檢測器（DAD）和熒光檢測器（FLD）并列檢測。流動相包括3種洗脫液：（A）乙腈，（B）甲醇和（C）四丁基羥胺

表1 HPLC 梯度洗脫程序

Table 1 Gradient elution program of HPLC

時間Time

（min）（A）乙腈Acetonitrile（%）（B）甲醇Methanol（%）

（C）TBA甲醇溶液TBAmethanol （%）00010022.025453028.0

70201038.070201038.10010040.000100 TBA： Tetrabutylammonium hydroxide.

醋酸甲醇混合液。洗脫液C配制方法：配制28 mmol/L TBA溶液（以醋酸調(diào)至pH 6.50），將TBA溶液與甲醇按體積比3∶7混合，過濾并超聲脫氣，可穩(wěn)定保存1星期。色譜梯度洗脫程序見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動相的選擇與梯度優(yōu)化 藻類光合色素種類較多，可分為3類：葉綠素（Chiorophylls）、類胡蘿卜素（Carotenoids）和藻膽蛋白（Phycobilinrotein）。葉綠素包括葉綠素a， b， c和d等。其中，葉綠素a， b和d含有葉綠醇側(cè)鏈，使其極性較弱，在反相色譜柱中具有較長的保留時間；葉綠素c類（c1， c2， c3）不含葉綠醇側(cè)鏈，故極性較強，保留時間較短。類胡蘿卜素包括胡蘿卜素（Carotenes）和葉黃素（Xanthophylls）。胡蘿卜素具有較強的親脂性，但葉黃素類極性中等。葉黃素類成分復雜，色譜保留時間介于葉綠素a， b和葉綠素c類之間。藻膽蛋白僅存在于藍藻、紅藻、隱藻和某些原綠球藻中，與葉綠素和類胡蘿卜素等性質(zhì)差異較大，本實驗不予研究。

葉綠素c類化合物極性較強，保留時間較短，部分組分（如Chlorophyll c2， Chlorophyll c1和Mg2，4二乙烯基脫鎂卟啉a5單甲酯（MgDVP）等）色譜分離比較困難，但該類化合物含有COOH基團，可以考慮在流動相中添加四丁基銨離子作為離子對試劑進行分離。四丁基銨離子作為流動相修飾劑被廣泛應(yīng)用于液相色譜復雜組分的分離\\。研究結(jié)果表明，葉綠素c類化合物保留時間與TBA濃度成正相關(guān)，但極性較弱的葉綠素a/b和類胡蘿卜素組分（無COOH基團）保留時間與TBA濃度相關(guān)性不強。隨著流動相TBA濃度增大，葉綠素c類化合物保留時間增加，但可以通過增大流動相中有機溶劑的比例（A， B洗脫液），控制其保留時間在10 min以內(nèi)。色譜分離首先考慮Chlorophyll c2， MgDVP和Chlorophyll c1的分離，同時兼顧弱極性組分的洗脫，所以在初始階段采用100% TBA甲醇溶液作為流動相，在0～22 min內(nèi)，流動相中乙腈和甲醇的比例分別線性增加至25%和45%，TBA甲醇溶液降為30%。在此階段，流動相中甲醇的比例和增加速度均超過乙腈，否則容易造成葉黃素組分，如19′丁酰氧巖藻黃素（19′Butfucoxanthin）/巖藻黃素（Fucoxanthin）、辣椒紅素（Capsanthin）/硅甲藻黃素（Diadinoxanthin）、玉米黃素（Zeaxanthin）/葉黃素（Lutein）等色譜峰的合并。在22～28 min時，流動相中乙腈比例迅速增大至70%，甲醇和TBA甲醇溶液比例分別降至20%和10%，隨后保持到38 min，以保證非極性組分的快速洗脫，同時能夠改善α胡蘿卜素（αCarotene）和β胡蘿卜素（βCarotene）的分離效果。

3.1.2 色譜柱與柱溫的選擇 本研究對3種類型色譜柱的分離效果進行了比較，包括Protein and peptide C18 （250 mm×4.6 mm，5.0 m）， 尤其是對出峰時間相近的葉黃素類組分的分離，填料粒徑較小的Eclipse C8色譜柱對該類色素組分的分離效果最佳。柱溫對色素的出峰時間影響顯著，柱溫低于40 ℃時，各化合物出峰時間明顯延長，導致樣品分析時間明顯增長。增加甲醇或乙腈比例，可縮短各組分的保留時間，但極易造成葉黃素類組分分離度變差。柱溫過高則不利于保護色譜柱。本研究柱溫選擇為50 ℃，以保證色素組分具有良好的分離度，同時， 樣品的分析時間控制在40 min內(nèi)， 色素的色譜圖如圖1所示。

圖1 光合色素HPLC分析圖

Fig．1 Chromatogram of photosynthetic pigments

藍線： 430 nm； 紅線： 440 nm； 綠線： 450 nm， 峰序號同表2。Blue line: 430 nm， red line: 440 nm， green line: 450 nm， peak numbers are same as in Table 2．

3.2 進樣量與加水比例的確定

水體和沉積物中的光合色素含量一般較低，而對提取液進行濃縮則增加了色素測定的難度，同時可能導致某些易降解色素的分解和轉(zhuǎn)化。目前，水體和沉積物色素提取液多采用直接進樣（非濃縮），HPLC進樣量主要在100～900 L。由于濾膜和沉積物中色素提取分別采用了95%甲醇和95%丙酮，提取液進樣之前需要混合適量水，以改善峰形。本研究分別采用水與提取液的比例為10∶90， 20∶80， 25∶75， 30∶70， 35∶65和40∶60（V/V）的混合液進行HPLC分析。結(jié)果表明，水與甲醇提取液的比例大于25∶75（V/V）時，光合色素（主要是出峰時間較早的極性組分）峰形較好，否則具有較大的前拖尾，而水與丙酮提取液的比例則需提高到35∶65（V/V）以上。

3.3 檢測波長的確定

采用二極管陣列檢測器掃描得到各物質(zhì)在紫外可見光區(qū)的最大吸收波長。結(jié)果表明，藻類光合色素的最大吸收波長主要集中在可見光區(qū)（430～450 nm），但不同色素的最大吸收波長不盡相同（數(shù)據(jù)未給出）。為了能同時測定這些物質(zhì)，采用3個波長檢測，分別為430， 440和450 nm，其中Pheophorbide a， Pheophythin a和Chlorophyll a在430 nm具有較高的靈敏度，所以這3種物質(zhì)的檢測波長均可采用430 nm，但其它色素的靈敏度相對偏低（圖1）。所以其它色素可以采用440或450 nm進行檢測。光合色素的熒光檢測對葉綠素c類和葉綠素a類化合物具有一定的靈敏度，但不能檢測類胡蘿卜素類組分，所以熒光檢測主要應(yīng)用于樣品中色素的鑒別，不應(yīng)用于定量分析。本研究采用熒光檢測的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為440和650 nm\\。

3.4 檢出限與線性范圍

在已確定的色譜條件下，進樣量為100 g/L）關(guān)系進行線性回歸（表2）。通過逐步降低標準溶液濃度，以信噪比S/N＝3作為基準，獲得23種光合色素的檢出限（表2）。由于標準品昂貴，本研究僅對GF/F濾膜進行了2個濃表2 光合色素的線性回歸方程、檢出限與回收率

Table 2 Regression equations，detection limits and recovery of photosynthetic pigments determined by HPLC

色譜峰

編號Peak

number化合物名稱Name線性方Linear regressionequation相關(guān)系數(shù)CorrelationCoefficient

（R2）線性范圍Linear range