高效液相色譜法測定海洋水體與沉積物中光合色素

摘 要 建立了海洋水體與沉積物中30種光合色素的反相高效液相色譜檢測方法。海水濾膜和沉積物分別采用95%甲醇和95%丙酮超聲萃取。萃取液混合一定比例的超純水后，采用Eclipse XDB C8反相柱進行分離，以乙腈（A）、甲醇（B）和四丁基羥胺甲醇（C）混合液為流動相進行洗脫，檢測波長為430， 440和450 nm，柱溫為50 ℃。色譜分離梯度為：0 min， 100% C；22 min，25% A， 45% B和30% C；28～38 min，70% A， 20% B和10% C；38.1～40 min，100% C。對23種已知濃度色素的線性關系、檢出限和加標回收率進行分析。結果表明，相關系數范圍為0.9972～0.9998，檢出限范圍為0.0305～0.7740 ng，加標回收率范圍為88.6%～103.3%。

關鍵詞 光合色素； 高效液相色譜； 海水； 沉積物； 海洋微藻

1 引 言

長期以來，海洋微藻分類主要以形態特征為依據，依靠專業人員采用顯微鏡檢測。但這種分析方法具有專業性要求高，費時費力等缺點；同時許多微型浮游植物缺少明顯的分類學形態特征，或存在無法固定保存及固定后易變形等問題，容易造成漏檢和誤檢\\。光合色素是藻類重要的生物標記物，不同種類的浮游藻類具有不同的色素組成和特征色素比值，以此為基礎的化學分類方法成為浮游藻類分類學的重要組成部分\\。光合色素種類多達幾百種，建立精確的光合色素定性與定量檢測方法是實現海洋微藻化學分類方法的關鍵，其中高效液相色譜方法（HPLC）是目前最成功的檢測方法\\。光合色素的HPLC分析在20世紀80年代獲得了快速發展，實現了葉綠素準確定量分析（不受降解產物影響）\\。隨著HPLC自動化程度的提高，大量現場樣品的光合色素分析成為可能。

1991年， Wright等\\采用C18柱實現了40種類胡蘿卜素和12 種葉綠素及其衍生物的分離。但該方法對一些重要的特征色素，如單乙烯基葉綠素（Chlorophyll a/b）和二乙烯基葉綠素（DV Chlorophyll a/b）， 以及葉綠素c2（Chlorophyll c2） 和c1（Chlorophyll c1）不能進行分離。Zapata等\\采用甲醇、乙腈、丙酮和吡啶的醋酸溶液為流動相，實現了包括葉綠素c類、Chlorophyll a和DV Chlorophyll a等色素的分離，但Chlorophyll b 和DV Chlorophyll b不能分離。van Heukelem等\\僅采用甲醇和水為流動相，并使用四丁基羥胺（TBA）作為修飾劑，改善流動相極性，Chlorophyll a/b和DV Chlorophyll a/b的分離效果良好，但葉綠素c類及胡蘿卜素分離效果欠佳\\。本研究采用C8色譜柱，以甲醇、乙腈和水為流動相，以TBA為修飾劑，建立了藻類光合色素分離新方法，對葉綠素c類、Chlorophyll a和DV Chlorophyll a等色素的分離效果良好。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜系統主要由Agilent1200系列組成，包括以下組件：G1311四元梯度泵，G1311自動進樣器，G1321A熒光檢測器，G1315C二極管陣列檢測器，Eclipse XDB C8反相柱（150 mm×4.6 mm，3.5 m，Aglient Technologies公司）。整套HPLC系統由Agilent ChemStation進行管理。針筒濾器（上海安譜公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；四丁基羥胺（TBA，JT Baker公司）。實驗用水均為經Millipore超純水系統生產的超純水。色素標準品（丹麥DHI公司），包括混合色素（含30種組分，未定量）和23種已知濃度的單標色素。

2.2 實驗步驟

2.2.1 樣品采集 于2011年2月在珠江口海域（E113°37′0.0″， N22°6′0.0″）和海南省陵水新村灣（E109°57′44.0″， N18°24′35.0″）采集水樣，于弱光下過濾到47 mm Whatman GF/F 玻璃纖維濾膜上，濾膜于20 ℃下冷凍保存，待分析。

2.2.2 色素提取 濾膜和沉積物色素提取參考文獻\\的方法。將冷凍的濾膜剪碎，置于聚乙烯塑料離心管中，用3 mL 95%（V/V）甲醇提取色素。沉積物于

L。采用二極管陣列檢測器（DAD）和熒光檢測器（FLD）并列檢測。流動相包括3種洗脫液：（A）乙腈，（B）甲醇和（C）四丁基羥胺

表1 HPLC 梯度洗脫程序

Table 1 Gradient elution program of HPLC

時間Time

（min）（A）乙腈Acetonitrile（%）（B）甲醇Methanol（%）

（C）TBA甲醇溶液TBAmethanol （%）00010022.025453028.0

70201038.070201038.10010040.000100 TBA： Tetrabutylammonium hydroxide.

醋酸甲醇混合液。洗脫液C配制方法：配制28 mmol/L TBA溶液（以醋酸調至pH 6.50），將TBA溶液與甲醇按體積比3∶7混合，過濾并超聲脫氣，可穩定保存1星期。色譜梯度洗脫程序見表1。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動相的選擇與梯度優化 藻類光合色素種類較多，可分為3類：葉綠素（Chiorophylls）、類胡蘿卜素（Carotenoids）和藻膽蛋白（Phycobilinrotein）。葉綠素包括葉綠素a， b， c和d等。其中，葉綠素a， b和d含有葉綠醇側鏈，使其極性較弱，在反相色譜柱中具有較長的保留時間；葉綠素c類（c1， c2， c3）不含葉綠醇側鏈，故極性較強，保留時間較短。類胡蘿卜素包括胡蘿卜素（Carotenes）和葉黃素（Xanthophylls）。胡蘿卜素具有較強的親脂性，但葉黃素類極性中等。葉黃素類成分復雜，色譜保留時間介于葉綠素a， b和葉綠素c類之間。藻膽蛋白僅存在于藍藻、紅藻、隱藻和某些原綠球藻中，與葉綠素和類胡蘿卜素等性質差異較大，本實驗不予研究。

葉綠素c類化合物極性較強，保留時間較短，部分組分（如Chlorophyll c2， Chlorophyll c1和Mg2，4二乙烯基脫鎂卟啉a5單甲酯（MgDVP）等）色譜分離比較困難，但該類化合物含有COOH基團，可以考慮在流動相中添加四丁基銨離子作為離子對試劑進行分離。四丁基銨離子作為流動相修飾劑被廣泛應用于液相色譜復雜組分的分離\\。研究結果表明，葉綠素c類化合物保留時間與TBA濃度成正相關，但極性較弱的葉綠素a/b和類胡蘿卜素組分（無COOH基團）保留時間與TBA濃度相關性不強。隨著流動相TBA濃度增大，葉綠素c類化合物保留時間增加，但可以通過增大流動相中有機溶劑的比例（A， B洗脫液），控制其保留時間在10 min以內。色譜分離首先考慮Chlorophyll c2， MgDVP和Chlorophyll c1的分離，同時兼顧弱極性組分的洗脫，所以在初始階段采用100% TBA甲醇溶液作為流動相，在0～22 min內，流動相中乙腈和甲醇的比例分別線性增加至25%和45%，TBA甲醇溶液降為30%。在此階段，流動相中甲醇的比例和增加速度均超過乙腈，否則容易造成葉黃素組分，如19′丁酰氧巖藻黃素（19′Butfucoxanthin）/巖藻黃素（Fucoxanthin）、辣椒紅素（Capsanthin）/硅甲藻黃素（Diadinoxanthin）、玉米黃素（Zeaxanthin）/葉黃素（Lutein）等色譜峰的合并。在22～28 min時，流動相中乙腈比例迅速增大至70%，甲醇和TBA甲醇溶液比例分別降至20%和10%，隨后保持到38 min，以保證非極性組分的快速洗脫，同時能夠改善α胡蘿卜素（αCarotene）和β胡蘿卜素（βCarotene）的分離效果。

3.1.2 色譜柱與柱溫的選擇 本研究對3種類型色譜柱的分離效果進行了比較，包括Protein and peptide C18 （250 mm×4.6 mm，5.0 m）， 尤其是對出峰時間相近的葉黃素類組分的分離，填料粒徑較小的Eclipse C8色譜柱對該類色素組分的分離效果最佳。柱溫對色素的出峰時間影響顯著，柱溫低于40 ℃時，各化合物出峰時間明顯延長，導致樣品分析時間明顯增長。增加甲醇或乙腈比例，可縮短各組分的保留時間，但極易造成葉黃素類組分分離度變差。柱溫過高則不利于保護色譜柱。本研究柱溫選擇為50 ℃，以保證色素組分具有良好的分離度，同時， 樣品的分析時間控制在40 min內， 色素的色譜圖如圖1所示。

圖1 光合色素HPLC分析圖

Fig．1 Chromatogram of photosynthetic pigments

藍線： 430 nm； 紅線： 440 nm； 綠線： 450 nm， 峰序號同表2。Blue line: 430 nm， red line: 440 nm， green line: 450 nm， peak numbers are same as in Table 2．

3.2 進樣量與加水比例的確定

水體和沉積物中的光合色素含量一般較低，而對提取液進行濃縮則增加了色素測定的難度，同時可能導致某些易降解色素的分解和轉化。目前，水體和沉積物色素提取液多采用直接進樣（非濃縮），HPLC進樣量主要在100～900 L。由于濾膜和沉積物中色素提取分別采用了95%甲醇和95%丙酮，提取液進樣之前需要混合適量水，以改善峰形。本研究分別采用水與提取液的比例為10∶90， 20∶80， 25∶75， 30∶70， 35∶65和40∶60（V/V）的混合液進行HPLC分析。結果表明，水與甲醇提取液的比例大于25∶75（V/V）時，光合色素（主要是出峰時間較早的極性組分）峰形較好，否則具有較大的前拖尾，而水與丙酮提取液的比例則需提高到35∶65（V/V）以上。

3.3 檢測波長的確定

采用二極管陣列檢測器掃描得到各物質在紫外可見光區的最大吸收波長。結果表明，藻類光合色素的最大吸收波長主要集中在可見光區（430～450 nm），但不同色素的最大吸收波長不盡相同（數據未給出）。為了能同時測定這些物質，采用3個波長檢測，分別為430， 440和450 nm，其中Pheophorbide a， Pheophythin a和Chlorophyll a在430 nm具有較高的靈敏度，所以這3種物質的檢測波長均可采用430 nm，但其它色素的靈敏度相對偏低（圖1）。所以其它色素可以采用440或450 nm進行檢測。光合色素的熒光檢測對葉綠素c類和葉綠素a類化合物具有一定的靈敏度，但不能檢測類胡蘿卜素類組分，所以熒光檢測主要應用于樣品中色素的鑒別，不應用于定量分析。本研究采用熒光檢測的激發波長和發射波長分別為440和650 nm\\。

3.4 檢出限與線性范圍

在已確定的色譜條件下，進樣量為100 g/L）關系進行線性回歸（表2）。通過逐步降低標準溶液濃度，以信噪比S/N＝3作為基準，獲得23種光合色素的檢出限（表2）。由于標準品昂貴，本研究僅對GF/F濾膜進行了2個濃表2 光合色素的線性回歸方程、檢出限與回收率

Table 2 Regression equations，detection limits and recovery of photosynthetic pigments determined by HPLC

色譜峰

編號Peak

number化合物名稱Name線性方Linear regressionequation相關系數CorrelationCoefficient

（R2）線性范圍Linear range