高靈敏納米金比色芯片檢測乙型肝炎病毒DNA及其變異

摘 要 構建了新型納米金比色芯片，利用Taq DNA連接酶的連接特異性，將其與乙型肝炎病毒DNA（HBVDNA）靶序列完全互補雜交的捕獲探針（固定在芯片上）和納米金修飾的探針連接成一條鏈，從而將納米金顆粒固定到芯片點陣上，再通過銀染反應放大， 形成裸眼可見的顯色信息。通過點陣的位置及灰度，即可判斷HBVDNA靶序列的單堿基突變，并得出相對定量信息。本實驗對不同濃度的HBVDNA靶序列進行了檢測。結果顯示： 此技術對單堿基突變有很強的特異性識別能力，并且具有較高的靈敏度（約10 pmol/L），在10～100 pmol/L濃度范圍內表現出較好的線性關系。該技術檢測時間短（＜1 h）、操作簡單、不需要特殊的檢測設備，具有很好的臨床應用前景。

關鍵詞 乙型肝炎病毒； 納米金； 基因芯片； Taq DNA 連接酶

1 引 言

我國是乙型肝炎高發區，流行病學調查表明\\，我國至少有8億人感染過乙型肝炎，乙肝表面抗原的攜帶率曾高達9.75%。在乙肝的治療方案中，通過抗HBV藥物抑制HBV復制是最重要和有效的方法之一，因此HBVDNA的定量檢測和耐藥性變異檢測在HBV病理研究與臨床診斷中具有重要意義\\。HBVDNA檢測的傳統方法有直接測序、S基因序列測定、ELISA基因型分型法和PCRRFLP基因型分型法等\\。近年來，基因芯片技術開始應用于疾病的診斷，它具有靈敏度高、結果準確和操作迅速簡便等優勢。但由于采用示蹤探針標記技術（酶、放射性同位素、熒光、化學發光等）比較昂貴，而且都有較高的儀器設備要求，限制了基因芯片在臨床檢測中的應用\\。

以納米金進行示蹤標記，結合納米金銀染增強技術，在基因芯片上可實現目標DNA的檢測\\。李瑋等\\基于納米金探針開發了可視化乙肝病毒基因芯片。但是，這些方法只能檢測DNA的濃度，而且對于雜交和清洗條件都有較高要求。本研究引入Taq DNA連接酶作為單堿基突變的識別工具，只需一步雜交和連接反應，將納米金顆粒捕獲固定在芯片點陣上，再經過銀染放大顯色即可判定結果，不僅可以檢測HBVDNA的濃度，而且可以識別HBVDNA的單堿基突變。本方法操作簡單，不需要特殊的檢測設備，而且通過修改探針的設計即可用于其它DNA的檢測，具有很好的應用前景。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Prosys5510A芯片點樣儀（美國Cartesian Technology公司）；V670紫外可見分光光度計（美國Jasco公司）；BX51顯微鏡和Qimage Retiga 2000R數碼相機（日本Olympus公司）；JEM2100透射電子顯微鏡（TEM，日本電子公司）；Centrifuge 5804R高速離心機（德國Eppendorf公司）；DY501電泳儀（上海萬達科技品格服務部）；Gel DocTM XR＋凝膠成像儀（美國BioRad公司）。

納米金溶液、基因芯片由本實驗室自行制備；氯金酸（Acros Organics公司）；0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）；1.0 mol/L NaCl；0.2×SSC洗液（含0.1% SDS）；銀染液（將1%明膠溶液、5.7%氫醌溶液、25.5%檸檬酸23.5%檸檬酸三鈉的混合液、20% AgNO3溶液順序以120:60:20:3的比例迅速混勻，配好即用）；NaNO3洗液；目標DNA和探針由上海生物工程技術有限公司合成（表1）。DNA連接酶（Taq DNA Ligase）及其反應緩沖液由美國BioLab公司提供。其它試劑為分析純， 實驗用水為超純水（美國Millipore公司MilliQ系統制備）。