米根霉胞內氨基酸的高效液相色譜測定及其代謝途徑分析

摘 要 建立了米根霉胞內代謝物提取方法定量評價體系，用100%甲醇作為提取劑獲得對米根霉胞內能荷物質最佳的提取效果。用HPLC法建立了米根霉產富馬酸體系胞內18種氨基酸的含量測定方法。采用異硫氰酸苯酯（PITC）作為柱前衍生化試劑，所有氨基酸在28 min內洗脫完畢。以Sepax AA柱（250 mm×4.6 mm， 5 m）為分析柱，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm， 以0.1 mol/L 醋酸鈉 （pH 6.5）乙腈 （93∶7， V/V） 為流動相A，乙腈水 （80∶20， V/V） 為流動相B，梯度洗脫。18種氨基酸在1.87～45.3 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數大于0.991；加標回收率在96.3%～102.7%之間；相對標準偏差在1.6%～2.9% 之間。運用本方法測定不同發酵時間米根霉胞內氨基酸的含量，得到其在發酵過程中的變化趨勢，并結合氨基酸代謝途徑分析了該發酵條件下富馬酸產量偏低的原因。

關鍵詞 高效液相色譜法； 柱前衍生化； 氨基酸； 米根霉

1 引 言

以米根霉為代表的絲狀真菌是重要的工業生產菌，目前作為生物反應器被廣泛應用于酶、抗生素、有機酸等物質的生產\\。對工業微生物進行胞內氨基酸分析有助于從整體上了解細胞內物質的代謝過程。但該類絲狀真菌的細胞壁組成較復雜，樣品預處理難度加大，會影響后續測定結果的準確性及重現性，因此急待建立其預處理評價體系。由于ATP， ADP， NAD等能荷物質的穩定性差，且均為微生物代謝過程中對生理活性影響較大的代謝產物，因此是驗證提取方法的高效性及穩定性的最佳內標物\\。

本研究建立了以于ATP， ADP， NAD為代表的能荷物質的預處理評價體系。并在此基礎上，以異硫氰酸苯酯（PITC）為柱前衍生劑\\，分析了米根霉產富馬酸體系胞內18種氨基酸，同時驗證了該預處理方法的有效性。并從發酵過程中氨基酸含量的變化對米根霉產富馬酸的代謝途徑進行了解析。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Summit高效液相色譜儀（美國戴安公司），由P680 HPLC泵、UVD170可變紫外檢測器、TCC2100柱溫箱、8125型進樣裝置組成；工作站（美國戴安Chromeleon系統）；Centrifuge 580R低溫離心機（美國Eppendorf公司）；MDFU32V超低溫冰箱80 ℃（日本SANYO公司）；RE52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

3種能荷物質（ATP， ADP， NAD）對照品，18種氨基酸對照品均購自Sigma公司；乙腈（色譜純），其它試劑均為分析純，實驗用水為飲用純凈水。米根霉誘變菌株MEF12（Rhizopus Oryzae MEF12，南京工業大學代謝工程實驗室保藏）。

2.2 實驗方法

2.2.1 培養基制備 （1）種子培養基 葡萄糖40 g/L，KH2PO4 0.1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，ZnSO4 17.6 mg/L，FeSO4 4.98 mg/L，pH 2.4；（2）發酵培養基 葡萄糖 40 g/L，Urea 0.1 g/L，KH2PO4 0.1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，ZnSO4 17.6 mg/L，FeSO4 4.98 mg/L。

2.2.2 發酵步驟 取1 mL米根霉孢子懸浮液 （濃度106個/mL）接入裝有50 mL種子培養基的250 mL三角平底瓶中，在35 ℃，200 r/min條件下恒溫搖床培養30 h得到種子液，接入7 L發酵罐（NBS）發酵。發酵條件：溫度35 ℃，攪拌轉速400 r/min，裝液量5 L，接種量10%，通氣量3.0 L/min，pH值由4 mol/L氨水控制在4.0。

2.2.3 殘糖測定 取10 mL發酵上清液至10 mL容量瓶內，定容后用SBA40c測糖儀測定殘糖。

2.2.4 富馬酸測定 取發酵混勻液1 mL至10 mL離心管中，再加入1 mL H2SO4和3 mL去離子水，80 ℃水浴加熱20 min后，取上清液0.5 mL定容到10 mL，用HPLC檢測\\。