原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法制備新型親水作用色譜固定相及其性能評價

摘 要 以自制的6.0 SymbolmA@ m單分散大孔交聯(lián)聚氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯（Poly（4-vinylbenzylchloride-co-divinylbenzene），PCMS/DVB）微球為基質(zhì)和引發(fā)劑，CuCl和自行合成的三[（2-二甲基氨基）乙基]胺（Tris[2-（dimethylamino）ethyl]amine， Me6TREN）組成混合催化體系，使4-乙烯基吡啶（4-Vinyl pyridine， 4-VP）在甲苯中進行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合，制得4-乙烯基吡啶聚合物，單體4-乙烯基吡啶的接枝率為8.55%。將該聚合物與正溴丁烷反應制得新型親水色譜固定相。在親水作用色譜模式下，流速1 mL/min，乙腈-水為流動相可分離5種芳胺化合物和4種酚類化合物。在離子交換色譜模式下，6 mmol/L Na2CO₃-5.5 mmol/L NaHCO₃為淋洗液可分別分離5種無機陰離子和4種短鏈有機酸。結(jié)果表明，此固定相對極性化合物和無機陰離子具有良好的分離性能，是一種性能優(yōu)異的親水作用色譜固定相。

關(guān)鍵詞 原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法; 單分散大孔交聯(lián)聚氯甲基苯乙烯-二乙烯苯微球; 親水作用色譜; 芳胺和酚類化合物; 無機陰離子

2011-05-30收稿；2011-08-18接受

本文系科技部重大基礎(chǔ)研究前期專項（No. 2009CB626608）， 國家自然科學基金（No. 21065008）和寧夏自然基金資助（No. NZ0838）

* E-mail: gongbl@nxu.edu.cn

1 引 言

色譜柱填料作為高效液相色譜（HPLC）的核心。提高色譜填料的柱效、柱容量、增大填料的pH使用范圍，具有多種分離模式以及對環(huán)境友好， 將成為色譜填料的發(fā)展方向。

親水作用色譜（HILIC）作為一種分離極性化合物的液相色譜模式，其概念是由Alpert[1]于1990年提出的。HILIC是一種以極性固定相（如硅膠、氨基鍵合硅膠等）及水-極性有機溶劑為流動相的色譜模式[2]，它與正相色譜相似，水是強溶劑，極性化合物比非極性化合物的保留時間長，與反相色譜的保留順序恰好相反。強極性化合物的分離問題引起了各個研究領(lǐng)域的重視，如藥物分析、代謝組學、蛋白質(zhì)組學等研究領(lǐng)域都不同程度地涉及強極性化合物的分離問題，近年來，HILIC 越來越受到關(guān)注和重視[3]。Liang等[4]使用“點擊化學（Click chemistry）”合成了HILIC固定相，制備了一系列以醇羥基為功能基團的HILIC固定相，用于分離堿基、核苷以及中藥中的強極性組分并取得了較好的效果。韓超等[5]以二醇基硅膠為固定相，研究了綠原酸，阿魏酸等有機酸的HILIC保留機理。

原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法（ATRP）是近年發(fā)展起來的一種新型聚合技術(shù)，具有修飾密度高、高聚合物鏈端可控等優(yōu)點，為克服現(xiàn)有固定相及其制備技術(shù)存在的缺陷提供了可能。ATRP集中了自由基聚合和活性聚合的優(yōu)點，條件溫和，操作較簡單，已經(jīng)獲得了許多新型聚合物。通過ATRP法在硅膠載體表面成功地合成嵌段、多枝聚合物[6]。同時，采用ATRP方法制備熱敏性聚合物也成為近年的研究熱點，如在硅膠表面聚合N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）溫敏型嵌段聚合物[7，8]。用ATRP技術(shù)制備離子色譜固定相的研究才起步，但已經(jīng)表現(xiàn)出優(yōu)異的應用潛力。Unsal等[9]用ATRP技術(shù)制備的強陽離子交換固定相柱容量比傳統(tǒng)方法有大幅度提高。Hemstroem等[10]用ATRP技術(shù)制備的反相色譜分離介質(zhì)具有優(yōu)異的抗水解性能。王婀娜等[11]采用ATRP技術(shù)將甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨聚合于硅膠表面，制得了強陰離子交換色譜填料，用于酸性蛋白質(zhì)的分離，取得了很好的效果。所以，采用ATRP技術(shù)，用有機聚合物對固體材料表面修飾是極具發(fā)展?jié)摿Φ姆蛛x介質(zhì)制備技術(shù)。

本研究采用ATRP聚合法將4-VP接枝到單分散大孔交聯(lián)PCMS/DVB微球表面，對其進行化學改性后制備新型色譜固定相。在親水作用色譜模式和離子色譜模式下，分別對芳胺、酚類化合物及無機陰離子、短鏈有機酸進行了分離研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；CGY-100型高壓氣動泵（北京福思源機械加工部）；Dionex ICS-90離子色譜儀；Dionex CSRS-I（4 mm）抑制器；JY-92超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KQ-250B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；生物顯微鏡（美國JEOL公司）；掃描電子顯微鏡（1000B， 美國）；LD5-2A型低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。

氯甲基苯乙烯（CMS）、二乙烯基苯（DVB），購于阿拉丁試劑有限公司；苯乙烯（St）、乙二胺四乙酸鈉（EDTA）、過氧化苯甲酰（BPO）、甲苯（上海試劑一廠）；聚乙烯醇（PVA，醇解度為88%，天津大學化工實驗廠），以上試劑均為化學純。氯化亞銅（CuCl）、N，N-二甲基苯胺、二苯胺、對甲苯胺、α-萘胺、間硝基苯胺、甲酚、乙萘酚、鄰苯二酚，間硝基酚（阿拉丁試劑有限公司）；三[（2-二甲基氨基）乙基]胺（ Me6TREN）根據(jù)文獻[12]合成。其它試劑均為分析純。

2.2 單分散交聯(lián)聚氯甲基苯乙烯—二乙烯苯微球的合成[13]

取適量聚苯乙烯種子液，加適量十二烷基硫酸鈉（Sodium lauryl sulfate， SDS）于30 ℃水浴攪拌； 圖1 交聯(lián)聚氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯微球的電鏡照片

Fig．1 Scanning electron micrograph of the monosized porous poly（4-vinylbenzylchloride-co-divinylbenzene） （PCMS/DVB） beads另取適量氯甲基苯乙烯、二乙烯苯、過氧化苯甲酰、甲苯及鄰苯二甲酸二丁酯，超聲乳化至無油滴時，迅速轉(zhuǎn)入種子液體系中，于30 ℃恒溫水浴中攪拌溶脹10～15 h，在此過程中，間隔性地在顯微鏡下，觀察種子表面是否溶脹，然后升溫至70 ℃聚合24 h，待聚合反應完成后，將產(chǎn)物用熱水反復洗滌，再分別用乙醇、丙酮洗滌數(shù)次，在索氏提取器中用甲苯抽48 h，即得到粒徑為5.0～10.0

SymbolmA@ m的單分散聚氯甲基苯乙烯-二乙烯苯微球，可取少量在顯微鏡下觀察其形態(tài)及大小?？刂茊误w、交聯(lián)劑等影響微球粒徑大小的量，制備6.0

SymbolmA@ m PCMS/DVB微球，微球的孔徑分布采用BET法測定，其平均孔徑14.9 nm，比表面積為80 m.2/g。圖1為粒徑為6.0

SymbolmA@ m PCMS/DVB微球的電鏡照片。

2.3 PCMS/DVB微球表面接枝聚4-VP制備親水作用色譜固定相

室溫下，在干燥100 mL兩頸燒瓶中依次加入4-VP單體，催化劑（CuCl），配體（Me6TREN），其物質(zhì)的量之比為100∶2∶4.5，然后再加入2 g PCMS/DVB微球和50 mL甲苯，超聲，反復抽真空、充氮氣循環(huán)多次后密封。在45 ℃油浴中反應24 h，反應結(jié)束后，依次用乙二胺四乙酸二鈉溶液、水、乙醇、丙酮洗滌后，40 ℃真空干燥，制得PCMS/DVB微球表面接枝聚4-VP聚合物。稱取2 g該聚合物，加入50 mL甲苯，3 mL正溴丁烷，在室溫下攪拌24 h，制得新型親水作用色譜固定相。合成路線見圖2。

圖2 親水作用色譜固定相的合成路線

Fig．2 Scheme for the synthsis of hydrophilic interaction liquid chromatographic（HILIC） stationary phase

2.4 色譜柱的裝填及色譜條件

以水為勻漿液和頂替液，在30 MPa壓力下以勻漿法將親水作用色譜填料裝入不銹鋼柱管（15 cm×0.46 cm I.D. ）中。液相色譜條件：乙腈-水為流動相，等度洗脫，檢測波長：254 nm。離子色譜條件：淋洗液為6 mmol/L Na2CO₃＋5.5 mmol/L NaHCO₃，再生液為36 mmol/L H2SO₄，使用前經(jīng)0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾；進樣體積 10

SymbolmA@ L。所有流動相在使用前均經(jīng)0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾。

3 結(jié)果與討論

3.1 親水作用色譜固定相接枝率的表征

表1給出PCMS/DVB 微球和4-VP單體接枝PCMS/DVB 微球的元素分析數(shù)據(jù)。由表1可見，4-VP接枝PCMS/DVB微球中N元素的含量明顯增加，表明4-VP已成功接枝到PCMS/DVB微球表面。比較4-VP-PCMS/DVB與色譜固定相C， H和N含量變化，可以確定正溴丁烷已與4-VP-PCMS/DVB發(fā)生化學反應。通過公式（1）計算接技率（Graftrate， GR）[14]。

GR（%）＝100×Np（10.3）Np（cal）×（1

Symbolm@@ Np/Np（cal））×S（1）

式中Np表示N元素在PCMS/DVB微球上增加的百分量， Np（cal）是4-VP單體中N元素的百分含量，S表示聚合物固定相的比表面積（m.2/g）。計算得4-VP的接枝率為8.55%。

表1 元素分析數(shù)據(jù)

Table 1 Data of elemental analysis

樣品Sample元素含量Element content （%， w/w）碳（C）氫（H）氮（N）4-乙烯基吡啶的接枝率

4-Vinylpyridine graft rate （%）

PCMS/DVB微球 PCMS/DVB beads 45.776.4110.031－

4-乙烯基吡啶聚合物 4-Vinylpyridine polymer46.396.0111.1718.55

親水作用色譜固定相 HILIC stationary phase47.246.0350.659

PCMS/DVB： Poly（4-vinylbenzye-chloride-co-divinylbenzene）.

3.2 固定相在親水作用色譜模式下分離性能考察

3.2.1 芳胺化合物的分離性能考察 HILIC對極性化合物具有很好的保留和分離選擇性，是解決各類極性化合物分離的可靠手段[15]。 本研究以乙 圖3 親水作用色譜模式下芳胺化合物的色譜分離圖

Fig．3 Chromatogram for separation of amines by HILIC mode

流速（Flow rate）：1.0 mL/min; 流動相（Mobile phase）：乙腈（Acetonitrile）-水（Water） （15∶85， V/V），檢測波長（λ）： 254 nm。1. N，N-二甲基苯胺（N，N-Dimethylaniline），2. 二苯胺（Diphenylamine），3. 對甲苯胺（p-Toluidine），4. α-萘胺 （α-Naphthylamine），5. 間硝基苯胺（m-Nitroaniline）。腈-水（15∶85， V/V）為流動相，在流速為1.0 mL/min的條件下， 分別對5種芳胺化合物進行分離。由圖3可知，5種胺類化合物在該固定相上被依次洗脫，洗脫的順序與胺類化合物的堿性一致。堿性越強，保留越弱。

3.2.2 流動相中水含量對芳胺類化合物保留行為的影響 圖4是流動相中不同水含量對5種芳胺化合物保留影響。從圖4可見，當流動相中水含量從40%增加到90%（V/V）時，5種溶質(zhì)的保留因子逐漸降低，符合親水作用保留機理，此結(jié)果與文獻一致[1，16～19]。隨著流動相中水含量增大，芳胺化合物的保留逐漸減弱，尤其對α-萘胺的保留影響最大。結(jié)構(gòu)中有吡啶環(huán)芳香結(jié)構(gòu)，另外，吡啶環(huán)接上正溴丁烷后，N為正離子結(jié)構(gòu)，因此該固定相與溶質(zhì)之間存在靜電引力、π-π作用。流動中的水與溶質(zhì)間存在氫鍵作用，隨著流動相中水含量逐漸增大，減弱了芳胺與固定相之間的作用，溶質(zhì)的保留逐漸減弱。

3.2.3 酚類化合物分離性能考察

圖5是以乙腈-水為流動相時4種酚類化合物的色譜分離圖，溶質(zhì)在固定相上的保留順序與溶質(zhì)的酸性強弱有關(guān)，溶質(zhì)酸性越強，在固定相上的保留越強。上述保留關(guān)系與溶質(zhì)和固定相間的靜電引力、π-π等相互作用有關(guān)。

圖4 流動相中不同水含量對芳胺保留時間的影響

Fig．4 Effect of water content in mobile phase on retention time of amines

流速（Flow rate）： 1.0 mL/min； 流動相（Mobile phase）：水含量由40%增加到90%（The water content increases from 40% to 90%），檢測波長（λ）: 254 nm。1. N，N-二甲基苯胺（N，N-Dimethylaniline）， 2. 二苯胺（Diphenylamine）， 3. 對甲苯胺（p-Toluidine）， 4. α-萘胺（α-Naphthylamine），5. 間硝基苯胺（m-Nitroaniline）。

圖5 酚類化合物的分離圖

Fig．5 Chromatogram for separation of hydroxylbenzenes by HILIC mode

流速（Flow rate）：1.0 mL/min，流動相（Mobile phase）-乙腈（Acetonitrile）-水（water） （25∶75， V/V），檢測波長（λ）：254 nm。1. 甲酚（p-Cresol）； 2. 乙萘酚（β-Naphthol）； 3. 鄰苯二酚（Pyrocatechol）； 4. 間硝基酚（m-Nitrophenol）。

3.3 固定相在離子交換色譜模式下分離性能考察

3.3.1 無機陰離子分離性能考察 為考察填料的離子交換色譜性能，選用6.0 mmol/L Na2CO₃-5.5 mmol/L NaHCO₃為淋洗液，在流速為1.0 mL/min的條件下，對5種無機 圖6 無機陰離子色譜分離Symbolm@@ ₃，這與常見無機陰離子的親水性強弱順序一致。在疏水性較強的色譜固定相上，離子大小對保留的影響通常大于離子的價數(shù)。固定相上帶有芳香性的六元雜環(huán)，該環(huán)與正溴丁烷反應后，使得填料的表面帶有電荷，與無機陰離子具有靜電引力作用。離子半徑大，電子云密度比較大的離子，保留較強。平行進樣10次，不同離子的出峰時間、峰高和峰面積具有良好的重現(xiàn)性。

3.3.2 線性關(guān)系和檢出限測定

在上述色譜條件下，進樣量10

3.3.3 4種短鏈有機酸分離性能考察 離子交換色譜模式下分離有機酸，能避免樣品中其它非離子性有機物的干擾。有機酸在水溶液中部分離解成COO.

Symbolm@@ ，與陰離子色譜填料的功能基相交換而被保留。

根據(jù)各種有機酸離解度、荷電性、親水性等性質(zhì)的差異而將其進行色譜分離。本研究采用自制親水作用色譜柱分別對甲酸、乙酸、一氯乙酸和草酸進行分離，分離結(jié)果見圖7。從圖7可見，4種有機酸在10 min內(nèi)被分離， 但草酸峰寬，電導響應值較低。

3.3.4 pH值對無機陰離子分離性能影響 淋洗液的pH值影響離子交換功能基、溶質(zhì)離子的存在形式，

影響保留。本研究固定NaHCO₃的總濃度不變，通過加入H₃BO₃和NaOH改變淋洗液的pH值，考察不同pH值下無機陰離子的保留行為變化，結(jié)果見圖8。從圖8可見，在pH＝8.0～10.0范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，各種無機陰離子的保留時間逐漸減小。這是因為H₃BO₃的加入，使得H2CO₃的離解平衡向左進行。HCO.

Symbolm@@ ₃的洗脫能力弱，無機陰離子的保留時間增長。當加入NaOH時，淋洗液中CO2

Symbolm@@ ₃的濃度增大，淋洗液與陰離子交換樹脂的親和力增強，洗脫能力強。本研究在pH＝8.25時，各無機陰離子得到最佳分離。

4 結(jié) 論

以6.0

SymbolmA@ m大孔單分散交聯(lián)PCMS/DVB微球為基質(zhì)和大分子引發(fā)劑，采用ATRP技術(shù)將4-VP成功的接枝到PCMS/DVB樹脂上，將此樹脂與正溴丁烷反應，制得新型色譜固定相。由于PCMS/DVB微球既是基質(zhì)，又是大分子引發(fā)劑，使原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應過程簡化，引發(fā)效率提高。在親水作用色譜模式下，可分離5種芳胺化合物和4種酚類化合物。在離子交換色譜模式下，可對5種無機陰離子和4種短鏈有機酸進行分離，且具有較好的線性關(guān)系和較低的檢出限。

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Preparation of Hydrophilic Interaction Chromatographic Stationary Phase

Using Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization and

Its Chromatographic Properties

WANG Fu-Qiang， CHANG Su-Ping， DAI Xiao-Jun， GONG Bo-Lin.*

（Key Laboratory of Energy Chemical Engineering， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract Atom transfer radical polymerization （ATRP） of poly-4-vinylpyridine-grafted PCMS/DVB beads were synthesized by using 6.0

SymbolmA@ m monodisperse macroporous poly（4-vinylbenzylchloride-co-divinylbenzene） （PCMS/DVB） beads as initiator， CuCl and tris［2-（dimethylamino）ethyl］ amine （Me6TREN） as catalyst and ligand in toluene. A new kind of hydrophilic interaction chromatographic （HILIC） stationary phase was synthesized by chemical modified of the poly-4-vinylpyridine-grafted PCMS/DVB beads. The grafting rate of poly-4-vinylpyridine was 8.55%. The column was tried as chroma-tographic packing for the separation of amines and hydroxybenzenes by HILIC modes and inorganic anions and organic acids by IC modes. The results showed that five amines and four hydroxybenzenes were completely separated in 10 min by acetonitrile-water as mobile phase with isocratic elution using the synthesized hydrophilic interaction chromatographic stationary phase. By using 6 mmol/L Na2CO₃-5.5 mmol/L NaHCO₃ as eluent， five inorganic anions and four organic acids had good linear relationship and low detection limit by IC model. The effect of water content in mobile phase on the retention of amines was evaluated. The stationary phase has good chromatographic properties for separation of polar compounds and inorganic anions.

Keywords Atom transfer radical polymerization method; Monodisperse macroporous poly （4-vinylbenzyl chloride-co-divinylbenzene） beads; Hydrophilic interaction chromatography; Separation of amines and hydroxybenzenes; Inorganic anions

（Received 30 May 2011; accepted 18 August 2011）