分子印跡固相萃取-氣相色譜-質譜法測定豬尿中4種β-受體激動劑

摘 要 建立了分子印跡固相萃取結合氣相色譜-質譜測定豬尿中β-受體激動劑氯丙那林、馬步特羅、克倫特羅、萊克多巴胺的方法。應用分子印跡柱富集并凈化豬尿液中4種β-受體激動劑，比較了分子印跡固相萃取與常規固相萃取的凈化效果。通過BSTFA-1% TMS硅烷化衍生，氘代克倫特羅和氘代萊克多巴胺為校正內標，氣相色譜-質譜測定。在優化條件下，4種β-受體激動劑在5～100

SymbolmA@ g/L范圍內具有良好的線性關系，線性相關系數大于0.99；方法檢出限低于0.5

SymbolmA@ g/L； 回收率為75.1%～97.5%； 相對標準偏差低于10%。利用本方法對實際樣品中克倫特羅和萊克多巴胺進行測定， 結果表明， 本方法的精密度和準確度較好；本方法無需液液萃取，操作簡單，準確性和穩定性好。

關鍵詞 分子印跡固相萃取； β-受體激動劑； 氣相色譜-質譜

2011-06-30收稿；2011-08-26接受

本文系“十二五”國家科技支撐計劃課題（No.2011BAD26B04）資助

* E-mail: zhihuaye@mail.caas.net.cn

1 引 言

克倫特羅通常用于治療支氣管炎[1]。因其具有水解脂肪、合成代謝和對非條紋肌肉組織的松弛作用，被非法用作動物養殖的促生長劑，提高動物的瘦肉產率。萊克多巴胺、氯丙那林和馬步特羅為合成類β-受體激動劑，與克倫特羅具有類似作用。不法分子在利益驅動下，將克倫特羅類似作用的β-受體激動劑類藥物用于動物養殖，如2011年河南“瘦肉精”事件，給常規檢測和日常監管帶來極大挑戰。為了確保動物源性食品安全，農業部176號和1519號公告中明確規定；禁止將克倫特羅、萊克多巴胺、氯丙那林和馬步特羅用于動物養殖。

β-受體激動劑類藥物的測定主要通過液液萃取[2]、固相萃取[3，4]和免疫親和萃取[5]等前處理技術進行凈化。液液萃取需要大量溶劑，且耗時；常規固相萃取分析速度快，所需溶劑量少，但選擇性差，難以消除復雜樣品基質影響；免疫親和固相萃取選擇性好，但成本較高，且應用條件苛刻。分子印跡固相萃取通過空間形狀、孔穴大小以及識別位點對目標分析物進行識別，能夠實現選擇性萃取和富集目標分析物，同時除去干擾物以減小基體抑制作用，提高分析方法的性能[6，7]。應用分子印跡固相萃取結合高效液相色譜串聯質譜研究建立動物組織中β-受體激動劑的測定方法已有報道[8～10]，但HPLC-MS/MS成本高，不易普及。王培龍等[11]應用分子印跡固相萃取結合氣相色譜-質譜研究建立了動物尿液中鹽酸克倫特羅的測定方法，方法具有很高的靈敏度、穩定性和可靠性。

本研究應用MIP固相萃取柱凈化和富集豬尿液中的克倫特羅、萊克多巴胺、氯丙那林和馬步特羅等β-受體激動劑，采用BSTFA-TMS衍生化，GC-MS對4種β-受體激動劑進行定性和定量分析。本方法能有效消除尿液的基體干擾，具有較低的檢出限和較高的精密度，能夠對豬尿液中克倫特羅、萊克多巴胺、氯丙那林和馬步特羅進行準確的定性和定量分析。本方法簡單、快速，結果令人滿意。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Trace DSQⅡ氣相色譜-質譜儀（美國Thermo Scientific公司）；DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25

SymbolmA@ m， 美國JW公司）；載氣為氦氣（純度99.999%）; DHG9070A型恒溫烘箱（上海精宏實驗室儀器設備公司）；移液槍（Eppendorf， Germany）分子印跡固相萃取小柱（β-Agonists， 10 mL， 25 mg， Lund， Sweden）； 甲醇、乙酸和甲苯（色譜純，Merck公司），其它試劑為分析純；N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷）（BSTFA-1% TMCS，SUPELCO公司）；鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，Clen）、萊克多巴胺（Ractopamine，Rac）、氯丙那林（Clorprenaline，Clp）和馬步特羅（Mabuterol，Mabu）、克倫特羅D9（Clen-D9）和萊克多巴胺D5（Rac-D5）購自Sigma公司；陰性豬尿液樣品和陽性豬尿液樣品由國家飼料質量監督檢驗中心（北京）提供。

2.2 標準溶液的配制

分別稱取鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、氯丙那林和馬步特羅等標準品（純度＞99.5%）各20.00 mg，溶于甲醇并定容至100 mL，該貯備液濃度為200 mg/L。采用甲醇對β-受體激動劑進行適當稀釋，獲得標準液。

2.3 樣品前處理

分子印跡固相萃取步驟如下： 豬尿液用前以3000 r/min離心10 min。取4 mL豬尿液，加入同位素內標，用25 mmol/L（pH 6.7）的乙酸銨緩沖液稀釋尿樣（1∶1，V/V）。MIP固相萃取柱依次用1 mL的甲醇、1 mL水和1 mL 25 mmol/L乙酸銨緩沖液活化。取稀釋后豬尿樣過柱。用1 mL水淋洗，真空泵抽干2 min。依次用1 mL含1％乙酸的乙腈溶液和1 mL 0.5 mol/L乙酸銨緩沖液（pH 5）進行淋洗，真空抽干2 min。用1 mL 10％乙酸/甲醇溶液洗脫2次，抽干2 min。控制整個過程中的流速為0.5 mL/min，洗脫流速為0.2 mL/min。取凈化后的樣品和4種β-受體激動劑標準溶液用氮氣吹干，加入100

SymbolmA@ L BSTFA＋1% TMS衍生化試劑，振蕩，密封，置于75 ℃的烘箱中衍生30 min，冷卻，用氮氣吹干。加入200

SymbolmA@ L甲苯溶解，振蕩，上機分析。

混合陽離子固相萃取柱（MCX）凈化步驟如下： 豬尿液用前以3000 r/min離心10 min。取4 mL離心后的豬尿樣，加入同位素內標，用HClO₄調至pH 5。MCX固相萃取柱用3 mL甲醇和3 mL水活化。上樣后，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，用3 mL含5%氨水的甲醇溶液進行洗脫，吹干。衍生化后待測。

2.4 色譜和質譜條件

儀器進樣口溫度為260 ℃；進樣量為1.0

SymbolmA@ L， 不分流模式；柱始溫為70 ℃保持1 min，以25 ℃/min程序升溫至200 ℃，保持6 min，再以25 ℃/min程序升溫至280 ℃，保持2 min。EI源電子轟擊能70 eV，檢測器溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，質量掃描范圍為70～400 AMU，溶劑延遲8 min。

3 結果與討論

3.1 儀器條件優化

為提高4種β-受體激動劑檢測的選擇性和靈敏度，采用選擇離子檢測模式（SIM）。利用4碎片離子的相對豐度結合保留時間可以對實際樣品中4種β-受體激動劑的衍生物譜峰進行確證。4種β-受體激動劑和2種氘代同位素內標的監測參數見表1。以Clen-D9為氯丙那林、馬步特羅和克倫特羅的內標， Rac-D5為萊克多巴胺的內標，對樣品中4種β-受體激動劑進行定量分析。

3.2 凈化效果比較

尿液組成復雜，含有大量尿酸、尿嘧啶和蛋白等雜質。同時動物個體差異也導致尿液基體組成變化較大。因此，尿液樣品基質干擾是影響β-受體激動劑測定因素之一，進而影響分析檢測的靈敏度和準確性。為了評價MIP與MCX固相萃取的凈化效果，4種β-受體激動劑在動物尿液中的添加濃度為10

SymbolmA@ g/L，通過MIP和MCX固相萃取凈化后衍生，應用GC-MS測定，得到4種β-受體激動劑的信噪比（表2）。由表2可知，MIP固相萃取能夠有效的消除尿液樣品基質對4種β-受體激動劑的影響，提高檢測的靈敏度和穩定性（圖1）。 圖1 β-受體激動劑及同位素內標色譜圖（50

SymbolmA@ g/L）

Fig．1 Chromatogram of β-agonists and isotope inner-standards（50

SymbolmA@ g/L）

3.3 方法的分析性能

衍生不同濃度梯度的β-受體激動劑標準溶液和內標溶液， 每個衍生化樣品平行進樣3次，獲得氯丙那林、馬步特羅、克倫特羅和萊克多巴胺的線性范圍為5～100

SymbolmA@ g/L，線性相關系數大于0.99。取尿液4 mL，用甲苯定容至200

SymbolmA@ L。在儀器狀態穩定的前提下，通過計算空白樣品信號的平均值（B）和標準偏差（SD），根據檢出限LOD＝B＋3SD和定量限LOQ＝

表3 豬尿液中β-受體激動劑分析方法參數

Table 3 Analytical parameters of developed method

化合物Compound線性范圍Linear range（

SymbolmA@ g/L）線性相關系數Correlation

coefficient檢出限LOD（

SymbolmA@ g/L）

氯丙那林 Clp5～1000.99310.2馬步特羅 Mabu5～1000.99570.2克倫特羅 Clen5～1000.99620.2萊克多巴胺 Rac5～1000.99250.5

B＋10SD獲得本方法對4種β-受體激動劑的檢出限和定量限（表3）。取添加不同濃度β-受體激動劑的豬尿液，通過MIP固相萃取小柱富集和凈化后衍生，GC-MS 分析結果見表4。由表4可見，分析方法重復性良好，相對標準偏差為2.5%～9.3%; 不同鹽酸克倫特羅加入量的加標回收率在71.0%～89.3%之間。

3.4 方法應用

克倫特羅和萊克多巴胺陽性尿樣經MIP固相萃取柱富集和凈化后，應用BSTFA＋1% TMS進行衍生化，GC-MS進行檢測，結果見表5。在優化條件下，本方法的精密度較好，相對標準偏差低于5%。在實際樣品測定過程中，通過空白尿液添加回收進行檢測結果質量控制，尿液中克倫特羅和萊克多巴胺的添加濃度為10

SymbolmA@ g/L，回收率分別為87.4%和75.2%。

References

1 Lichtenstein A H， Deckelbaum R J. Circulation， 2001， 103（8）: 1177～1179

2 Debrauwer L， Bories G. Anal. Chim. Acta， 1993， 275（122）: 231～239

3 Koole A， Jetten A C， Luo Y， Franke J P， Zeeuw R A. J. Anal. Toxicol.， 1999， 23（7）: 632～635

4 WU Yin-Liang， YANG Ting， SHAN Ji-Hao， HUANGFU Wei-Guo. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（6）: 833～837

吳銀良， 楊 挺， 單吉浩， 皇甫偉國. 分析化學， 2010， 38（6）: 833～837

5 Brambill G， Fiori M， Curiel I， Serpe L， Gallo P. Analyst， 1998， 123（12）: 2693～2696

6 Toorisaka E， Uezu K， Goto M， Furusaki S. Biochemical Engineering Journal， 2003， 14（2） : 85～91

7 Chianella I， Piletsky S A， Tothill I E， Chen B， TurnerA P F. Biosensors and Bioelectronics， 2003， 18（2）: 119～127

8 Anders B， Christine B， Anna H， Fredrik L， Borje S， Kees E. J. Chromatogr. A， 2002， 975（1）: 157～164

9 Christine W， Fredrik L， Maurizio F， Cinzia C， Sabrina M. Gianfranco B. J. Chromatogr. B， 2004， 804（1）: 85～91

10 Kootstra P R， Kuijpers C J， Wubs K L， Doorn D， Sterk S S， Ginkel L A， Stephany R W. Anal. Chim. Acta， 2005， 529（1-2）: 75～81

11 WANG Pei-Long， FAN Li， SONG Rong， GAO Sheng. Chinese J. Anal. Chem.，2007， 35（9）: 1319～1322

王培龍，范 理，宋 榮，高 生. 分析化學， 2007， 35（9）: 1319～1322

Determination of Four Kinds of β-Agonists in Swine Urine by

Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction Followed Gas

Chromatography Coupled Mass Spectrometry

WANG Pei-Long， FAN Li， SU Xiao-Ou， YE Zhi-Hua.

（Institute of Quality Standards and Testing Technologies for Agro-products，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Abstract A simple and rapid method for the determination of β-agonists including Clorprenaline， Mabuterol， clenbuterol and ractopamine in swine urine by using molecular imprinted solid phase extraction followed with gas chromatography-mass spectrometry has been developed. 4 β-Agonists in swine urine were concentrated and cleaned-up by using molecularly imprinted polymer（MIP） solid phase extraction cartridge， the comparison study of clean up effect for the MIP and common solid phase extraction cartridge was carried out. Then the purified sample was derivatized by using N，O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide （BSTFA） containing 1% trimethylchlorosilane （TMCS） and were determined by gas chromatography-mass spectrometry （selected ion mode）. Under the optimized conditions， there is a good linear correlation （the calibration coefficient is above 0. 99） between the ratio of peak areas and the concentration of β-agonists in the range of 5－100

SymbolmA@ g/L. the limit of quantitative （LOQ） is 0.5

SymbolmA@ g/L for ractopamine and 0.2

SymbolmA@ g/L for other β-agonists in swine urine samples， the recoveries of different quantities of the β-agonists spiked in swine urine are between 75.1% and 97.5% ， the relative standard deviations （RSD） are below 10%. The developing method was applied to the determination of clenbuterol and ractopamine in real urine samples， the precision of the results is good， the manipulation of the developed method is simple and fast comparing to other methods.

Keywords Molecular imprinted solid phase extraction; β-Agonists; Gas chromatography-mass spectrometry

（Received 30 June 2011; accepted 26 August 2011）