固相萃取-液相色譜-串聯質譜法同時測定尿液中9種多環芳烴代謝物

摘 要 建立了固相萃取-液相色譜-串聯質譜同時測定尿中2-羥基萘、1-羥基萘、2-羥基芴、3-羥基菲、1-羥基芘等9種多環芳烴代謝物的液相色譜-串聯質譜測定方法。尿樣中結合態的多環芳烴代謝物在β-葡萄糖苷酸酶-芳基硫酸酯酶緩沖液（pH 5.0）作用下，于37 ℃水浴中避光水解4 h后，以C18固相萃取小柱富集、凈化，以甲醇洗脫，采用Waters Symmetry C18色譜柱，流動相為乙腈-0.2%氨水（72∶27， V/V）等度淋洗分離后進入質譜測定。在噴霧電壓4 kV，毛細管溫度300 ℃下，以3-羥基菲13C為內標，采用SRM模式負離子掃描方式測定，內標法定量。9種多環芳烴代謝物在尿中的線性范圍為0.90～100

SymbolmA@ g/L；相關系數為0.9970～0.9990；回收率為79.0%～119.8%；相對標準偏差為4.3%～12.4%；檢出限為0.04～0.90

SymbolmA@ g/L；結果表明，本方法可用于尿中9種多環芳烴代謝物的測定。

關鍵詞 液相色譜-串聯質譜； 尿； 多環芳烴代謝物

2011-04-25收稿；2011-06-14接受

本文系國家“十一五”科技支撐基金（No.2006BAI19B01）資助項目

* E-mail: shaobin_lin@yahuoo.com.cn

1 引 言

多環芳烴（PAHs）是最早被人類發現的一類環境致癌化合物，主要來源于煤炭、石油、木材等有機物的熱解和不完全燃燒。PAHs數量多、分布廣， 與人類健康關系密切，是相當重要的致癌類化合物［1］。PAHs對人體健康的影響一直是研究熱點。檢測內暴露水平對預測和評估人群接觸PAHs具有重要意義。PAHs經人體代謝后轉化成葡萄糖苷酸或硫酸鹽化合物，從尿液排出。因此通過測定尿液中PAHs代謝物，可以綜合反映人體對PAHs的暴露情況。目前，研究最多的PAHs代謝物是芘的代謝物1-羥基芘（1-OHP）。但最近發現，1-OHP與尿中的其它OH-PAHs的相關性不強，因此僅采用1-OHP作為生物標志物并不能真實地反映人體的PAHs暴露水平。為了全面反映各類人群的PAHs的內暴露水平和減小或消除個體差異帶來的影響，須使用多個OH-PAHs作為共同生物標志物反映PAHs的內暴露水平。目前檢測OH-PAHs的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[2，3]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[4～6]、液相色譜-質譜法（LC-MS）[7～11]。與液相色譜-質譜法（LC-MS）方法比較，高效液相色譜法（HPLC）檢出限過高，不適用于非暴露人群的檢測；而氣相色譜-質譜法（GC-MS）雖然檢出限低，靈敏度高，但需要衍生化處理，而且，其前處理凈化過程需要多柱聯用，處理過程繁瑣、耗時；液相色譜-質譜法（LC-MS）具有靈敏度高，檢出限低的特點，在OH-PAHs的檢測中具有優勢。目前，利用固相萃取（SPE）-LC-MS測定的OH-PAHs的方法已多有報道。Ferrari等[7]測定了1-OHP；Wiele等[8]同時測定1-OHN，1-OHP， 7-OHBap等8種OH-PAHs；Xu等[10]同時測定了萘、芴、菲、芘等13種OH-PAHs；朱鵬飛等[11]同時測定了4種OH-PAHs。本研究以13C同位素為內標，利用SPE-LC-MS/MS同時測定人尿樣中的多種OH-PAHs，包括2-羥基萘、1-羥基萘、2-羥基芴、3-羥基菲、3-羥基屈、6-羥基屈、1-羥基苯并[a]蒽、1-羥基芘和9-羥基苯并[a]芘。與Xu等[9]的方法比較，本方法縮短了水解時間、減少了濃縮步驟、將流動相梯度淋洗改為等度淋洗，從而減少了有機溶劑的使用量，縮短了樣品的前處理和測定時間，提高了部分化合物的檢出限。與Wiele等[5]的方法比較，由于檢測樣品的基質不同，樣品的檢出限和回收率等暫時無法比較，但將流動相梯度淋洗改為等度淋洗，縮短了樣品的測定時間。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LTQ-XL液相色譜-質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific） ：配電噴霧離子化源（ESI源）；漩渦振蕩器（中國IKA-MS2）；24孔固相萃取裝置（美國SupelcosilTM）； Envi-18固相萃取柱（3 mL，500 mg，美國Supelco公司）；超純水機（Barnstead超純水機）。甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck公司）；乙酸鈉、乙酸為分析純（北京化學試劑公司）；實驗用水為經Barnstead超純水機過濾的去離子水；氮氣、氦氣（＞99.999%）。1-羥基芘、2-羥基芴、β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶購于Sigma-Aldrich公司，1-羥基萘、2-羥基萘購于Dr. Ehrenstorfer GmbH， 3-羥基屈、1-羥基苯并（a）蒽、9-羥基苯并[a]芘購于Midwest Research Institute公司；6-羥基屈購于Accustandard公司，3-羥基菲、3-羥基菲13C同位素內標（＞99.5%）購自Cambridge Isotope Laboratories公司。

OH-PAHs的標準溶液：準確稱取適量的OH-PAHs化合物的標準品，以甲醇為溶劑，配成不同濃度的標準儲備液，然后按表1配制混合標準中間液和混合標準使用液。

醋酸-醋酸銨緩沖溶液：準確稱取740.0 g無水醋酸銨，溶解在500 mL水中，即配成醋酸銨飽和溶液，加入冰醋酸（冰醋酸與飽和醋酸銨的體積比約為1∶1），用冰醋酸調至pH＝5.0，即配成所需醋酸-醋酸銨緩沖溶液。

水解酶溶液（現用現配）：依據當天處理樣品的數量，按照每個樣品使用3000 U β-葡萄糖苷酸酶，70 U芳基硫酸酯酶的量，根據所購β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶的含量，計算本次處理樣品所需水解酶的量（通常多計算出一份樣品的量）后，準確稱量β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶的量，用醋酸-醋酸銨緩沖溶液定容至樣品數×10 mL。

2.2 樣品前處理

將冷凍人尿樣品放置常溫，用0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾后，準確吸取10.0 mL尿樣于25.0 mL玻璃試管中，加入10.0 mL水解酶溶液（含3000 U β-葡萄糖苷酸酶和70 U芳基硫酸酯酶），加入50

SymbolmA@ L 200

SymbolmA@ g/L的3-羥基菲13C同位素內標，混合放入37 ℃水浴中避光水解4 h，得水解液。然后用5.0 mL 甲醇、5.0 mL 水活化3 mL （500mg） C18固相萃取小柱（小柱不能流干），將水解液通過C18固相萃取小柱富集，用1.0 mL 水清洗柱，流干后，繼續抽干5 min，再以1.0 mL甲醇緩慢洗脫后，以甲醇定容至1.0 mL，混勻后進入LC-MS/MS測定。

2.3 色譜-質譜條件

Waters Symmetry C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m）；流動相為乙腈-0.2%氨水（72∶27， V/V）等度淋洗；流速500

SymbolmA@ L/min；進樣量20

SymbolmA@ L。

質譜采用電噴霧離子源（ESI）， 負離子掃描方式，選擇反應監控（SRM）; 噴霧電壓4 kV，毛細管溫度300 ℃，鞘氣11 arb，輔助氣4 arb， 各化合物的質譜采集參數見表2。

3 結果與討論

3.1 色譜和質譜條件的選擇

本實驗選用了Symmetry C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m）、Symmetry C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5

SymbolmA@ m）、Symmetry C8 色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5

SymbolmA@ m）和Atlantis dC18 色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3

SymbolmA@ m）進行實驗。結果表明，150 mm色譜柱對某些同分異構體的分離效果較差，而Symmetry C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m）可將9種OH-PAHs完全分離，故本實驗選用Symmetry C18 色譜柱作為分析柱。在流動相的選擇中，研究了乙腈-水及乙腈-0.2%氨水的等度淋洗和梯度淋洗，發現OH-PAHs在乙腈-0.2%氨水（72∶27， V/V）等度淋洗時同樣可以達到梯度淋洗的效果，而且還減少了梯度淋洗的平衡時間，從而縮短了樣品分析時間。在液相色譜檢測OH-PAHs時常用甲醇-水為流動相，但在本實驗中，甲醇-水在負離子模式下測定的噪聲比較大，選用乙腈-水后，噪聲降低，但檢測的靈敏度仍然較差。在流動相中加入0.2%氨水后，通過去除OH-PAHs流動相中的H.＋， 從而提高了靈敏度和選擇性。

分別將9種OH-PAHs的標準溶液進行MS分析，確定2-羥基萘、1-羥基萘、2-羥基芴、3-羥基菲、3-羥基屈、6-羥基屈、1-羥基苯并[a]蒽、1-羥基芘、9-羥基苯并[a]芘和3-羥基菲13C內標的分子離子峰[M

Symbolm@@ H].

Symbolm@@ 分別是m/z 143，143，181，193，217，243，243，243，267和199。在較低的能量下分別對各個分子離子進行二級質譜掃描，確定各物質的特征離子峰。在測定中，采用選擇反應監控（SRM）模式進行數據采集，具體參數見表2，9種OH-PAHs的標準色譜圖見圖1。

Fig．1 Chromatogram of mixed standard solution

A . 2-羥基萘 （2-OHN）； B． 1-羥基萘（1-OHN）； C. 2-羥基芴 （2-OHF） ；D . 3-羥基菲（3-OHPH）；E. 3-羥基菲13C內標 （3-OHPH 13C）； F. 1-羥基芘 （1-OHP）；G. 3-羥基屈（3-OHC） ；H. 6-羥基屈 （6-OHC）；I. 1-羥基苯并[a]蒽（1-OHBAA）；J. 9-羥基苯并[a]芘 （9-OHBAP）

3.2 前處理條件的選擇

在很多測定OH-PAHs的方法中，都將洗脫液濃縮后進行測定。為了比較濃縮對實驗結果的影響，取2份平行尿樣，分別加入等量的標準品， 在37 ℃避光水解4 h，將水解液通過C18固相萃取小柱富集、清洗后，一份用1.0 mL甲醇進行洗脫，定容至1.0 mL后直接測定。另一份用5.0 mL甲醇進行洗脫后放入濃縮儀中，在35 ℃下真空濃縮后，定容至 1.0 mL后，測定。結果表明，樣品經過濃縮儀濃縮后，由于部分目標化合物會隨著溶劑一同蒸發，所以導致1-羥基萘、2-羥基萘損失嚴重，而其它OH-PAHs也有損失。因此，本實驗省略濃縮步驟，直接進樣，既節約了時間，又可以達到良好實驗效果。

由于尿樣的本底比較復雜，為了清除部分雜質，提高實驗的靈敏度，本實驗在水解液通過C18固相萃取小柱富集后，增加了清洗過程。為最大程度洗去雜質，減小OH-PAHs的損失，分別使用甲醇-水（1∶1， V/V）、甲醇-水（1∶2， V/V）和純水進行清洗，結果表明，用甲醇-水（1∶1， V/V）和甲醇-水（1∶2， V/V）清洗，目標化合物損失都較大，純水清洗效果較好。本實驗采用1.0 mL純水清洗萃取柱中的雜質。空白尿樣和加標尿樣的色譜圖如圖2和圖3所示。

3.3 穩定性實驗

選用濃度為30.0

SymbolmA@ g/L標準溶液，在常溫下避光保存，每隔2 h測定其濃度。結果表明，處理后的樣品在24 h內測定，其濃度無明顯變化。

3.4 線性方程和檢出限

用OH-PAHs混合標準溶液配制0.00， 1.00， 3.00， 5.00， 10.0， 30.0， 50.0和100

SymbolmA@ g/L的標準溶液，分別加入相同濃度的3-羥基菲13C內標（內標濃度為10.0

SymbolmA@ g/L），在設定條件下，分別取樣20

SymbolmA@ L，注入LC-MS/MS中進行分析，以標準系列峰面積與內標峰面積之比對其質量濃度做線性回歸方程，以3倍信噪比計算檢出限。結果表明，在1.0～100

SymbolmA@ g/L濃度范圍內具有良好的線性結果（表3）。

3.5 回收率和精密度

取3份同一尿樣的平行樣品，加入一定濃度的混合標準溶液，經前處理后，分別進樣，進行OH-PAHs的加標回收實驗。取6份同一尿樣的平行樣品，經前處理后，分別進樣，進行精密度實驗，實驗結果見表4。由表4可知，方法回收率為79.0%～119.8%；相對標準偏差為4.3%～12.4%。

3.6 樣品測定

應用本方法測定了260份樣品，其中2-羥基萘的檢出率為77.8%，平均濃度為46.9

SymbolmA@ g/L; 1-羥基萘的檢出率為38.8%，平均濃度為2.43

SymbolmA@ g/L; 1-羥基芘的檢出率為15.4%，平均濃度為0.28

SymbolmA@ g/L。表明本方法可用于尿中多環芳烴代謝物的檢測要求。

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Simultaneous Determination of Nine Phenolic Metabolites of

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Human Urine by

Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

DING Chang-Ming， JIN Yin-Long， LIN Shao-Bin.*

（Institute for Environment Hygiene and Health Related Product Safety，

Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 100021， China）

Abstract A method was developed for the simultaneous determination of nine phenolic metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons （OH-PAHs） in human urine， i.e. 2-hydroxynaphthalene， 1-hydroxynaphthalene， 2-hydroxyfluorene， 3-hydroxyphenanthrene， 1-hydroxypyrene， 3-hydroxychrysene， 6-hydroxychrysene， 1-hydroxybenz［a］ anthracen， 9-hydroxybenzo［a］ pyrene by solid-phase extraction-liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）. After adding the internal standard （13C3-Hydroxyphenanthrene）， the urine samples were hydrolyzed by enzyme （pH 5.0） at 37 ℃ for 4 h， then cleaned up and concentrated on C18 SPE column， and then the targeted compounds were analyzed by LC-MS/MS under negative ion mode using Waters symmetry C18 column as analyzed column. The mobile phase was CH₃CN∶NH₃#8226;H2O （0.2%）＝72∶27 （volume ratio）. The spray voltage was 4 KV. The capillary temperature was 300 ℃. The linear ranges were 0.90－100

SymbolmA@ g/L. The correlation coefficients were 0.9970－0.9990. The detection limits were 0.04－0.90

SymbolmA@ g/L. The recoveries were 79.0%－119.8%. The relative standard deviations were 4.3%－12.5%（n＝6）. The method has been used for the simultaneous determination of nine phenolic metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons （OH-PAHs） in human urine.

Keywords Liquid chromatography tandem mass spectrometry; Urine; Phenolic metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons

（Received 25 April 2011; accepted 14 June 2011）