基質與樣品的相互作用對于傅立葉變換離子回旋共振質譜測定低分子量多肽的影響

摘 要 通過比較兩種極性差異較大的基質2，5-二羥基苯甲酸（DHB）和2′，6′-二羥基苯乙酮（DHAP）按不同比例混合時，Angiotensin Ⅱ的基質輔助激光解析電離-傅立葉變換離子回旋共振質譜（MALDI-FT/ICRMS）譜圖的不同，并結合基質-Angiotensin Ⅱ在不同結晶方式下的共結晶和基質晶體的掃描電鏡照片，發現基質為10

SymbolmA@ mol/L DHB和15

SymbolmA@ mol/L DHAP以體積比4:1組成的混合物時，基質結晶為致密的層狀結構，而以薄層法與Angiotensin Ⅱ生成的共結晶，Angiotensin Ⅱ在基質晶體上面形成分散的柱狀小晶體，此時得到的MALDI-FT/ICRMS質譜圖優于干滴法。

關鍵詞 基質輔助激光解析電離; 傅立葉變換離子回旋共振質譜; 肽; 薄層法; 干滴法

2011-06-15收稿；2011-11-10接受

* E-mail: chenjun05@tsinghua.org.cn

1 引 言

傅立葉變換離子回旋共振質譜（FT/ICRMS）是一種具有高質量分辨率的質譜技術[1，2]。FT/ICRMS的主要優點是分辨率在一個較寬的質荷比范圍內極高，可以達到10.5 ～10.6[3]。在一定的頻率范圍內，只要在足夠長的時間內進行采樣，均可獲得高分辨數據，獲得高的質量準確性[4～6]。

基質輔助激光解析電離技術（MALDI）是一種軟電離技術，利用其對于肽類及蛋白樣品的分析較為深入[7]，樣品的前處理是該技術的關鍵步驟。常見的樣品前處理技術主要包括MALDI靶上前處理和基質的選擇。靶上前處理方法主要有：利用靶上修飾物與分析物的特異吸附作用，富集分析物[8]；通過浸洗步驟除鹽，增加質譜靈敏度[9]等。采用MALDI源對分析物進行電離時，基質的主要作用是分散分析物和傳遞激光能量。分析物均勻地分散于基質內，也被形象地稱為固態溶液[10]。形成這種固態溶液要求基質和分析物的極性具有一定的相似性[10]。因此，選擇合適的基質以及采用適當的基質樣品共結晶，對于MALDI技術非常重要。對于肽類分析的基質為2，5-二羥基苯甲酸（DHB）[11]，也有文獻報道利用2′，6′-二羥基苯乙酮（DHAP）和檸檬酸氫二銨（DAHC）的混合物作為基質，取得了更好的分析效果。MALDI-MS檢測多肽類化合物往往能夠得到較多的碎片離子，而利用DHAP/DAHC的混合基質得到的碎片離子少很多[12，13]。還有文獻報道，以香豆素類化合物與DHB為混合基質，分析多糖和糖蛋白，效果較好[14]。目前，MALDI源的基質樣品共結晶方式主要有干滴法\\，薄層法及三明治法。這3種方式本身無優劣之分，在對于具體基質和分析物時，要通過實驗考察，以確定最佳的共結晶制備方式。

本研究選取了兩種極性差異較大的多肽分析常用基質DHB和DHAP[10]，通過考察配比混合基質\\，樣品制備方式\\，激發激光能量等實驗條件對短鏈多肽MALDI-FT/ICRMS分析的影響，并結合基質與分析物共結晶的掃描電鏡照片，分析基質組成和結晶方式對于化合物質譜行為的影響。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

920傅立葉變換離子回旋共振質譜儀（7T磁體，美國Varian公司）；MALDI激光源為Orion air-cooled Nd:YAG （美國New Wave Research公司），其固定激發波長為532，355和266 nm；S-3700N掃描電鏡和E-1045離子濺射儀（日本Hitachi公司）。

2，5-二羥基苯甲酸（2，5-Dihydroxybenzoic acid，DHB， TCI-EP，東京化成工業株式會社）；2′，6′-二羥基苯乙酮（2′，6′-Dihydroxyacetophenone，DHAP），Leu-Val和Angiotensin Ⅱ（10

SymbolmA@ mol/L，美國Sigma-Aldrich公司）；乙腈（色譜純，美國CNW公司）；實驗用水經Milli-Q Integral 3 A10純水系統制備。

基質儲備液配制：精確稱取DHB和DHAP，加入乙腈-水（1∶1，V/V）溶液，分別配制濃度為10和15

SymbolmA@ mol/L的儲備液，置于4 ℃保存。混合基質溶液是將DHB和DHAP儲備液分別按照體積比1∶1，2∶1，1∶2，3∶1，1∶3，4∶1和1∶4混合使用。

2.2 樣品準備

2.2.1 MALDI-FT/ICRMS樣品制備 （1）薄層法 在MALDI靶上分別點加1，2，3和4

SymbolmA@ L的DHB或DHAP，以及各不同比例的混合基質溶液，于空氣中揮干后，再分別點加1

SymbolmA@ L二肽和多肽溶液，于空氣中揮干。（2）干滴法 預先分別將2.1節中各基質溶液與Angiotensin Ⅱ溶液按照體積比1∶1混合，在MALDI靶上點樣2

SymbolmA@ L，以保證樣品點包含的基質與分析物的絕對量與薄層法制得的樣品點中相同。（3）三明治法 在薄層法制樣的基礎上，再點加相同體積的基質溶液。

2.2.2 電鏡樣品制備 將1

SymbolmA@ L 2.1節中各基質溶液，以及2.2.1中的各基質與待分析樣品混合溶液點樣于導電玻璃上，空氣中揮干。在基質溶液揮干后的痕跡上，再次點加1

SymbolmA@ L Angiotensin Ⅱ溶液，于空氣中揮干，然后再次點加1

SymbolmA@ L基質溶液，空氣中揮干。分別得到純基質晶體。分別采用干滴法、薄層法和三明治法制備晶體。置于離子濺射儀中，10 mA，噴金30 s。

2.3 FT/ICRMS參數設置

數據收集軟件為Omega （9.0 beta， Varian）。對于Leu-Val掃描范圍為m/z 150～300，對于Angiotensin Ⅱ掃描范圍為m/z 150～2000，正離子模式檢測，掃描時間為262.144 ms，經兩次采集，得到512 K寬帶瞬間時域。質譜質量軸通過PEG400進行校準。

3 結果與討論

3.1 DHB和DHAP作為基質用于Leu-Val的分析

按照薄層法，分別以DHB和DHAP為基質， Leu-Val的MALDI-FT/ICRMS譜圖如圖1所示。各主要離子的精確質量和分辨率分別為：253.1635（50200）；275.1452（42400）；291.1191（42500）。

圖1 10

SymbolmA@ mol/L DHB （A）和15

SymbolmA@ mol/L DHAP （B） 各1

SymbolmA@ L作為基質測定Leu-Val的質譜圖

Fig．1 Mass spectrometry of Leu-Val with 1

SymbolmA@ L 10

SymbolmA@ mol/L 2，5-dihydroxybenzoic acid（DHB） （A） and 15

SymbolmA@ mol/L 2，6-dihydroxyacetophenone （DHAP） （B） as matrix

Leu-Val的計算分子量為230。m/z 253為[M＋Na].＋峰，m/z 275為[M

Symbolm@@ H＋2Na].＋峰，m/z 291為[M

Symbolm@@ H＋Na＋K].＋峰。DHAP為基質時，與DHB為基質一樣，m/z 275峰作為基峰，m/z 291峰降低45.74%，m/z 253峰強增強17.89%。這表明DHAP有抑制Leu-Val結合多個堿金屬離子的能力。

當基質體積增加為2

SymbolmA@ L時（圖2），DHB組中，基峰仍然為m/z 275，而m/z 291峰強下降41.93%，而m/z 253.16峰強上升36.58%。在DHAP組中，m/z 253成為基峰，而m/z 291低于檢出限而未被檢到。此結果更證實了DHAP有抑制Leu-Val與多個堿金屬離子結合的能力。當基質體積增加到4

SymbolmA@ L時，DHB組得到的譜圖與2

SymbolmA@ L無明顯區別，而DHAP組雜峰明顯增加，而準分子離子峰下降明顯。

圖2 10

SymbolmA@ mol/L DHB （A）和15

SymbolmA@ mol/L DHAP （B）各2

SymbolmA@ L測定Leu-Val的質譜圖

Fig．2 Mass spectrometry of Leu-Val with 2

SymbolmA@ L 10

SymbolmA@ mol/L DHB （A） and 15

SymbolmA@ mol/L DHAP （B） as matrix

3.2 DHB和DHAP作為基質用于Angiotensin Ⅱ的分析

Angiotensin Ⅱ的氨基酸序列為Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe，計算分子量為1045.54。按照薄層法，分別用1

SymbolmA@ L的DHB和DHAP作為基質對Angiotensin Ⅱ進行分析（圖3）。DHB作基質時，準分子離子峰簇主要有m/z 1090（1.34%），m/z 1068（6.31%）和m/z 1046（100%），分別為[M

Symbolm@@ H＋2Na].＋，[M＋Na].＋和[M＋H].＋；主要碎片離子為m/z 931，899，802，784和767，分別為[MSymbolmA@ L作為基質測定angiotensin Ⅱ的質譜圖

Fig．3 Mass spectrometry of angiotensin Ⅱ with 1

SymbolmA@ L 10

SymbolmA@ mol/L DHB （A） and 15

SymbolmA@ mol/L DHAP （B） as matrix

3.3 DHB和DHAP混合作為基質用于Angiotensin Ⅱ的分析

將10

SymbolmA@ mol/L DHB和15

SymbolmA@ mol/L DHAP按照體積比分別為1∶1，1∶2，2∶1，1∶3，3∶1，1∶4和4∶1混合制成混合基質。由于DHB和DHAP的活性氫摩爾比為3∶2，故二者的摩爾濃度比選擇為2∶3，以確保在任何體積比混合時，使活性氫摩爾數相同。

樣品結晶方式采用薄層法。比較7種不同配比混合基質條件下MALDI-FT/ICRMS譜圖數據發現，當體積比為1∶3和1∶4時，分子離子峰強度下降明顯。而體積比為1∶1，1∶2，2∶1和3∶1時，譜圖與純DHB為基質時較為相似。而當VDHB∶VDHAP＝4∶1時， [M＋Na].＋峰減弱73.4%，且 [M

Symbolm@@ H＋2Na].＋峰未被測到。這表明，VDHB∶VDHAP＝4∶1時，能夠將DHB對Angiotensin Ⅱ的離子化能力和DHAP降低Angiotensin Ⅱ與多個堿金屬結合的能力相結合，從而更好地提高靈敏度和選擇性。基質體積為1～2

SymbolmA@ L時，譜圖差異不大，但當基質體積大于3

SymbolmA@ L后，譜圖信號減弱明顯。

3.4 不同樣品制備方式的比較

干滴法、薄層法和三明治法在MALDI-MS實驗中均有廣泛運用[15]。本研究比較了VDHB∶VDHAP＝4∶1時， 不同制備方式對FT/ICRMS響應的影響。干滴法點樣量為2

SymbolmA@ L，而薄層法基質點樣量和樣品點樣量均為1

SymbolmA@ L。結果表明，樣品制備方式對Angiotensin Ⅱ的MALDI-FT/ICRMS響應的影響甚大。薄層法得到的譜圖主要是準分子離子峰（圖4A），而干滴法得到的準分子離子峰強度甚小（圖4B），碎片離子的種類明顯多于薄層法，且有m/z 453這個在薄層法得到的譜圖中未被檢測到的離子。此結果顯示，薄層法對于Angiotensin Ⅱ的檢測更為適合。而造成這一現象的原因則可能是由于干滴法中，基質與Angiotensin Ⅱ作用較強，Angiotensin Ⅱ更多的被包埋在基質晶體之內，而難以被激發成為氣態離子，而從基質中吸收的能量迫使Angiotensin Ⅱ的化學鍵斷裂，形成較多的碎片離子。干滴法中得到了薄層法中未得到的碎片離子，更證明了這兩種方法導致的Angiotensin Ⅱ在質譜中的裂解原理不同。三明治法是薄層法結晶的基礎上，再點加適量基質溶液，再次結晶。Angiotensin Ⅱ在基質為DHB-DHAP（4∶1，V/V）溶液，基質點樣體積為1

SymbolmA@ L×2，樣品體積為1

SymbolmA@ L時，激光能量從30%增加至40%，質譜圖中均未發現樣品碎片。

圖4 薄層法（A）和干滴法（B）測定Angiotensin Ⅱ的質譜圖

Fig．4 Mass spectrometry of angiotensin Ⅱ prepared by thin-layer （A） and dry-droplet method （B）

基質為1

SymbolmA@ L的10

SymbolmA@ mol/L DHB-15

SymbolmA@ mol/L DHAP（4∶1，V/V）混合基質，激光能量為30%。The matrix is 1

SymbolmA@ L mixture of 10

SymbolmA@ mol/L DHB-15

SymbolmA@ mol/L DHAP（4∶1，V/V）， and the laser energy is 30%.

3.5 不同激發能量的比較

由于不同激發能量對于化合物的質譜裂解行為十分重要，能量過高，將導致碎片離子過多；能量不足，則導致靈敏度嚴重下降。本實驗主要針對于3.4節的樣品，考察了激光能量分別為15%，20%，25%，30%和 35%時，對質譜響應的影響。當能量低于25%時，兩種制樣方法均未能得到質譜響應。當激光能量為25%和30%時，同種制樣方式的譜圖并未有明顯區別。而當能量為35%時，薄層法得到的譜圖中碎片明顯增多，而分子離子峰強度下降顯著；干滴法得到的譜圖中，m/z 453和 437顯著增強，其它碎片被基線噪音淹沒，同時分子離子峰強度下降十分明顯。此結果也證明了m/z 437和 451主要來源于Angiotensin Ⅱ的裂解，且是不同于薄層法的質譜裂解方式。

3.6 不同基質結晶和與樣品共結晶的形態比較

利用掃描電鏡，觀察基質混合后其結晶形態發生明顯變化（圖5）；不同的制樣方式得到的基質與Angiotensin Ⅱ的共結晶形態也明顯不同（圖6）。

從外形上看，DHAP的結晶相對DHB小很多（圖5A，5B）。當DHB和DHAP以體積比2∶1混合時，結晶形態發生了較為明顯的改變（圖5C）;當DHB和DHAP體積比為4∶1混合時（圖5D），形成的結晶為較為致密的層狀結構。干滴法得到的晶體（圖6A）比純基質晶體（圖5D）更為致密。而以薄層法共結晶時，Angiotensin Ⅱ在基質晶體表面形成分散的柱狀晶體（圖6B），能夠同時滿足分散分析物和避免基質包埋分析物的要求，因此其質譜行為優于干滴法。

圖5 4種不同組成基質結晶的掃描電鏡照片

Fig．5 Scanning electron microscope picture of 4 kinds of matrix

A. DHB； B. DHAP； C. 10

SymbolmA@ mol/L DHB-15

SymbolmA@ mol/L DHAP（2∶1，V/V）；D. 10

SymbolmA@ mol/L DHB-15

SymbolmA@ mol/L DHAP（4∶1，V/V）.圖6 不同制備方式的基質與Angiotensin Ⅱ共結晶掃描電鏡照片

Fig．6 Scanning electron microscope picture of matrix-analyte crystal by different preparation methods

A. 干滴法； B. 薄層法； C. 三明治法。A. Dry-droplet method; B. Thinlayer method; C. Sandwich method

從電鏡照片可見，三明治法所得到的晶體結構與干滴法所得晶體十分相似，但又比干滴法所得晶體顆粒大（圖6C）。這一結果提示，在該實驗條件下，采用三明治法Angiotensin Ⅱ無法得到質譜響應的可能原因是基質的過度包埋，使得分析物難以解析成為離子。

4 結 論

研究結果表明，DHAP有抑制Leu-Val和Angiotensin Ⅱ與堿金屬離子結合的能力。當DHAP含量適當時，譜圖中準分子離子峰中結合堿金屬峰強含量較低，且碎片離子較少。而當DHAP含量較高時，其抑制結合堿金屬的能力導致分析物離子化效果不佳，從而引起靈敏度下降。10

SymbolmA@ mol/L DHB和15

SymbolmA@ mol/L DHAP以體積比4∶1混合時，基質結晶為致密的層狀結構，而以薄層法與Angiotensin Ⅱ共結晶，Angiotensin Ⅱ在基質晶體上面形成分散的柱狀小晶體，此時得到的MALDI-FT/ICRMS質譜圖最佳。

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Effect of Interaction of Matrix and Analyte on Detection of

Low Molecular Weight Peptide by Matrix Assisted Laser

Desorption Ionization-Fourier Transform/Ion

Cyclotron Resonance Mass Spectrometry

CHEN Jun.*， YIN Jun， GAO Shuai， XU Li， XIAO Hong-Zhan

（Beijing Institute of Microchemistry， Beijing 100091， China）

Abstract Because of the suppression of 2′，6′-dihydroxyacetophenone （DHAP） to the combination of peptide with alkali metal ion and the advanced ability of 2，5-dihydroxybenzoic acid （DHB） to ionize peptide in MALDI-MS， it is illustrated in this work that the best MALDI-FT/ICRMS is obtained when matrix is composed of 10

SymbolmA@ mol/L DHB and 15

SymbolmA@ mol/L DHAP. The scanning electron microscope pictures of matrix with different compositions show that the crystal of matrix composed of 8

SymbolmA@ mol/L DHB and 3

SymbolmA@ mol/L DHAP is in a dense stratiform state that is quite different from crystal of matrix with other proportion of DHB and DHAP. It is also demonstrated that thin-layer method is the best peptide preparation method with matrix composed of 8

SymbolmA@ mol/L DHB and 3

SymbolmA@ mol/L DHAP among dry-droplet and sandwich method.

Keywords Matrix assisted laser desorption-ionization; Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry; Peptide; Thinlayer method; Dry-droplet method

（Received 15 June 2011; accepted 10 November 2011）