微囊藻毒素分子印跡傳感器的制備與應(yīng)用

摘 要 以鄰氨基酚為單體，微囊藻毒素（MC-LR）為模板，采用循環(huán)伏安法在金電極的表面電聚合成膜分子印跡材料，制備了傳感器。采用安培法對(duì)MC-LR進(jìn)行檢測(cè)。在制備影響條件最佳值（pH＝4.5；單體/模板＝1.4×10.8∶1；洗脫時(shí)間 10 min）的基礎(chǔ)上，對(duì)該傳感器的線性范圍、使用壽命、選擇性等進(jìn)行了研究，并與液相色譜方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明： 該傳感器對(duì)MC-LR具有良好的選擇性和靈敏度，線性范圍為0.05～0.35 mg/L；加標(biāo)回收率為80%～105%；檢出限為7.3

SymbolmA@ g/L。與液相色譜方法對(duì)比，當(dāng)置信度為99%時(shí)，無(wú)系統(tǒng)誤差。

關(guān)鍵詞 微囊藻毒素； 分子印跡； 電聚合； 傳感器

2011-06-30收稿；2011-09-21接受

本文系北京市自然科學(xué)基金（No.2102015）資助項(xiàng)目

* E-mail：cuilf@th.btbu.edu.cn

1 引 言

微囊藻毒素（Microcystins， MCs） 是一種在藍(lán)藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素[1]。微囊藻毒素的種類較多，目前發(fā)現(xiàn)有大約80種異構(gòu)體[2]，其中含量較多，存在較普遍，毒性較大的是LR， YR和RR，其中L，R和Y分別代表Leu（亮氨酸）、Arg（精氨酸）和Tyr（酪氨酸）。而MC-LR是目前已知的毒性最強(qiáng)、急性危害最大的一種淡水藻類毒素，是最強(qiáng)的肝臟腫瘤促進(jìn)劑[3]。目前。檢測(cè)水中MCs的常用方法有生物法、生物化學(xué)法、生物傳感器法、分子信息檢測(cè)技術(shù)、色譜檢測(cè)技術(shù)等[4]，這些方法都有各自的不足，如高效液相色譜法預(yù)處理過(guò)程繁瑣，設(shè)備昂貴等。Tong等[5]將高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器-單層碳納米角技術(shù)（SWNHs）用于快速檢測(cè)微囊藻毒素（MC-LR），并通過(guò)拉曼光譜、X衍射光譜、掃描電子顯微鏡、透射電鏡技術(shù)進(jìn)行表征。分子印跡電化學(xué)法與此生物傳感器法相比，它的制備過(guò)程比較簡(jiǎn)單，無(wú)需制備MC-LR抗體；它與天然的識(shí)別系統(tǒng)，如酶和底物，抗體和抗原相比，具有抗惡劣環(huán)境的能力，表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性和長(zhǎng)的使用壽命。

分子印跡技術(shù)（MIT）通過(guò)分子印跡聚合物（MIPs）對(duì)模板分子的“記憶”效應(yīng)達(dá)到對(duì)目標(biāo)分子的特異性選擇[6]，在分離科學(xué)[7，8]，傳感器技術(shù)[9] 和痕量物質(zhì)富集[10]等方面有廣闊的應(yīng)用前景。而電聚合法制備分子印跡傳感器因具有均勻、重現(xiàn)性好、納米級(jí)厚度、制備簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)條件要求低等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以鄰氨基酚為單體，微囊藻毒素（MC-LR）為模板，采用循環(huán)伏安法在金電極的表面聚合成膜分子印跡傳感器，利用K₃Fe（CN）6為印跡電極和底液間的探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微囊藻毒素的檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

AUT070416型電化學(xué)工作站（瑞士萬(wàn)通中國(guó)有限公司）；Wsters-1525高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；金電極（φ＝3 mm，天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司）；鉑電極和飽和甘汞電極（江蘇金壇電分析儀器廠）；KQ-400DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山動(dòng)超聲儀器有限公司）。微囊藻毒素MC-LR標(biāo)準(zhǔn)樣品（E-LR-C100 Microcystin-LR≥ 95%，臺(tái)灣）；鄰氨基酚（北京理工大學(xué)科技開發(fā)公司）；K₃Fe（CN）6（北京化工廠）； 其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水。

2.2 金電極的預(yù)處理

金電極在0.3

SymbolmA@ m A12O₃粉末上拋光成鏡面。依次用稀HNO₃（1∶1，V/V），無(wú)水乙醇，蒸餾水超聲洗滌，每次3 min。在K₃Fe（CN）6溶液中，在

Symbolm@@ 0.1～0.6 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安法（CV）掃描直至達(dá)到穩(wěn)定，用去離子水洗凈待用。

2.3 分子印跡傳感器敏感膜的制備

采用三電極體系進(jìn)行電聚合，金電極為工作電極。以藻毒素（MC-LR）為模板分子，鄰氨基酚為功能單體，以0.10 mol/L HClO4溶解0.065 g鄰氨基酚，用0.40 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 4.50，加入4.50 mg/L MC-LR溶液。用CV法在

Symbolm@@ 0.2～1.2 V范圍內(nèi)掃描30圈，掃描速度為50 mV/s，平衡時(shí)間為10 s。聚合膜沉積在電極的表面，用10 mL甲醇-水（4∶1， V/V）進(jìn)行超聲洗脫10 min，將模板分子從電極上除去，制成留有模板分子構(gòu)型空穴的分子印跡聚合物薄膜。在同樣條件下，與未加模板分子制備的非印跡膜電極進(jìn)行對(duì)比。

2.4 檢測(cè)方法

采用三電極裝置：印跡傳感器為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極。在室溫條件下，將印跡電極浸入到5.00 mmol/L K₃Fe（CN）6溶液中，當(dāng)背景電流達(dá)到穩(wěn)定后，加入MC-LR溶液。采用循環(huán)伏安法對(duì)印跡傳感器進(jìn)行電化學(xué)表征。以示差脈沖法的電流值與MC-LR濃度的關(guān)系進(jìn)行定量測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 分子印跡電聚合

聚合過(guò)程中，鄰氨基酚與藻毒素MC-LR之間發(fā)生離子鍵或氫鍵的作用。圖1為模板分子MC-LR存在下鄰氨基酚在金電極上電聚合的循環(huán)伏安曲線。由圖1可知，此聚合是不可逆的過(guò)程，在0.6 V處有一個(gè)明顯的氧化還原峰，隨著循環(huán)掃描次數(shù)的增加，電流強(qiáng)度急劇下降，這是由于在聚合過(guò)程中形成了一層致密的不導(dǎo)電的電聚合膜，從而改變循環(huán)伏安響應(yīng)曲線值。

3.2 分子印跡敏感膜的表征

采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電化學(xué)表征，并用掃描電鏡（SEM）分析。由圖2可見，裸電極有明顯的氧化還原峰，而未洗脫的印跡電極無(wú)氧化還原峰，即電極表面生成了完全不導(dǎo)電的聚合膜。經(jīng)洗脫后有低于裸電極的峰電流，說(shuō)明印跡分子MC-LR被洗脫，印跡分子被洗脫以后，印跡膜的表面留有許多不規(guī)則的空穴，F(xiàn)e（CN）3

Symbolm@@ 6通過(guò)空穴擴(kuò)散到電極表面進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，所以洗脫后的印跡電極氧化還原峰要高于未洗脫的印跡電極。

圖1 鄰氨基酚（OAP）電聚合過(guò)程中的循環(huán)伏安曲線

Fig．1 Cyclic voltammograms of O-aminophenol （OAP） electropolymerization procedure

a. 聚合第一圈（The first circle）； b. 余下的圈數(shù)（The remaining circle）。

Fig．2 Cyclic voltammograms of different electrodes

a. 裸電極（Bared electrode）； b. 洗脫后的分子印跡膜電極（MIP-modified electrode after remove the imprinting molecules）； c. 洗脫前的分子印跡膜電極（MIP-modified electrode befor remove the imprinting molecules）。

對(duì)裸電極及洗脫模板分子前后的分子印跡膜進(jìn)行掃描電鏡（SEM）分析（圖3）。裸電極的表面可以看到由于打磨留下的明顯劃痕（圖3A），聚合后已形成一層平滑聚合膜覆蓋在電極的表面（圖3B），聚合膜經(jīng)洗脫模板分子后膜表面形成了不規(guī)則的空穴（圖3C）。

Fig．3 SEM photographs of molecular imprinted membrane

A. 裸電極（Bared electrode）; B. 印跡后電極（MIP-modified electrode）； C. 洗脫后電極（Eluted electrode）\\.

3.3 聚合條件影響

3.3.1 pH值的影響 鄰氨基酚在中性和堿性溶液中得到無(wú)活性膜，用循環(huán)伏安法在酸性溶液中電聚合，則可得到均勻的活性聚鄰氨基酚膜[11]。本實(shí)驗(yàn)在 pH 2.5～6.5的酸性環(huán)境中進(jìn)行聚合。當(dāng)pH＝4.5時(shí)，洗脫前后的峰電流差值最大，即洗脫下的印跡分子MC-LR最多，說(shuō)明在此pH條件下印跡效果最好，所以pH＝4.5為本實(shí)驗(yàn)的最佳值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

3.3.2 單體模板比例的影響 單體與模板的比例較小時(shí)，難以形成穩(wěn)定的印跡點(diǎn)位，過(guò)多的模板阻礙了單體間的聚合，不易形成聚合物。單體與模板的比例較大時(shí)，容易形成單體之間的直接聚合，導(dǎo)致分子的包埋現(xiàn)象。由圖5可知，當(dāng)單體與模板的質(zhì)量比為1.4×10.8∶1時(shí)，電化學(xué)檢測(cè)的MC-LR的濃度最大。

Fig．4 Influence of pH

Fig．5 Influence of monomer/ template ratio

3.3.3 洗脫時(shí)間的影響 由于鄰氨基酚膜不溶于甲醇[10]，而藻毒素溶于甲醇，所以選取甲醇-水（4∶1，V/V）洗脫。洗脫 圖6 洗脫時(shí)間影響曲線圖

Fig．6 Influence of elution time時(shí)間不充分則不能形成有特定吸附點(diǎn)的空穴。實(shí)驗(yàn)表明，洗脫時(shí)間為10 min時(shí)，洗脫下的MC-LR濃度值最大，以后趨于平緩（見圖6）。

3.4 傳感器的性能指標(biāo)

3.4.1 線性范圍、檢出限及使用壽命 應(yīng)用示差脈沖法研究了傳感器在K₃Fe（CN）6本底溶液中加入不同濃度的MC-LR后的響應(yīng)。結(jié)果表明，MC-LR濃度在0.05～0.35 mg/L范圍內(nèi)成線性關(guān)系，線性方程為y＝51.09x

Symbolm@@ 2.2148，相關(guān)系數(shù)為0.992。

按照HJ168-2010環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢出限的要求，在相同的分析條件下，重復(fù)18次空白試驗(yàn)，計(jì)算檢出限為7.3

SymbolmA@ g/L。

用連續(xù)洗脫的方法檢測(cè)使用壽命，隨著使用次數(shù)的增加，傳感器的使用壽命逐漸減小，當(dāng)使用25次時(shí)，電極的衰減率已大于30%。 圖7 印跡電極在不同被測(cè)物中的示差脈沖曲線

Fig．7 Differential pulse curves of imprinted electrode in different solution

a. 5.00 mmol/L K₃Fe（CN）.6; b. a＋0.05 g/L D-甘露糖（D-Mannose）; c. a＋0.05 g/L L-組氨酸（L-Histidine）; d. a＋0.3 mg/L MC-RR。

3.4.2 印跡敏感膜的選擇性 選取水體中的天然有機(jī)物（糖類、氨基酸）和與MC-LR結(jié)構(gòu)相似的MC-RR驗(yàn)證分子印跡膜的特異選擇性。測(cè)定結(jié)果如圖7所示，a為印跡電極的峰電流，曲線b、c和d的峰電流明顯比e高，說(shuō)明MC-LR印跡傳感器對(duì)D-甘露糖和L-組氨酸幾乎沒(méi)有響應(yīng)，由于MC-RR與MC-LR結(jié)構(gòu)上具有相似性，印跡電極對(duì)MC-RR具有較小的響應(yīng)，所以曲線d的峰電流略低于b和c；而D-甘露糖和L-組氨酸的結(jié)構(gòu)與MC-LR相差較大，與印跡空穴不匹配，因而不能封閉空穴，F(xiàn)e（CN）3

Symbolm@@ 6擴(kuò)散不受阻礙，導(dǎo)致電極對(duì)加入干擾物后的K₃Fe（CN）6溶液的峰電流與印跡電極峰電流幾乎沒(méi)變化，因此印跡電極對(duì)兩者未顯示特異選擇性。

3.4.3 分子印跡傳感器方法與液相色譜方法性能分析對(duì)比 取MC-LR的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用高效液相色譜法和電化學(xué)分子印跡方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)誤差檢驗(yàn)，結(jié)果見表1。

經(jīng)計(jì)算，F(xiàn)計(jì)算＝2.66，置信度為95％，查F分布表（單邊），F(xiàn)（0.025，4，4）＝9.60，F(xiàn)計(jì)算＜ F（0.025，4，4），則說(shuō)明這兩種方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果精密度不存在系統(tǒng)誤差。查t分布表，得t（0.01，8）＝3.66，t（0.05，8） ＝ 2.31，計(jì)算得t計(jì)算＝2.84。t計(jì)算＜t（0.01，8），當(dāng)置信度為99%時(shí)，電化學(xué)分子印跡方法與高效液相色譜方法在準(zhǔn)確度上不存在系統(tǒng)誤差；t計(jì)算＞t（0.05，8），所以置信度為95%時(shí)，存在系統(tǒng)誤差。說(shuō)明印跡傳感器和HPLC測(cè)定的結(jié)果具有可比性，此傳感器可快速檢測(cè)富營(yíng)養(yǎng)化水體中的MC-LR。

3.5 實(shí)際水樣分析

取3種實(shí)驗(yàn)室自培養(yǎng)的富營(yíng)養(yǎng)水體，定量加入K₃Fe（CN）6，配制成5.00 mmol/L K₃Fe（CN）6溶液，分別用制備好的分子印跡傳感器檢測(cè)MC-LR的含量，分析MC-LR濃度各3次，取其平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方法的加標(biāo)回收率見表2， 結(jié)果令人滿意。

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Preparation and Application of Microcystins

Sensor Based on Molecular Imprinting

SHEN Qing.1， CUI Li-Feng*1， ZHAO Shuo.2， LI Ke.1

.1（Food institute， Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China）

.2（Qinggong College， Hebei United University， Tangshan 603000， China）

Abstract A molecularly imprinted film sensor was prepared by cyclic voltammetry on a gold electrode surface using O-aminophenol as the monomer， microcystin （MC-LR） as a template， and then MC-LR was determined by amperometry. The optimum preparation conditions for the sensor were as follows: pH＝4.5， monomer/template＝1.4×10.8∶1; elution time＝10 min. The characteristics of the sensor such as the linear relationship， service life， selectivity were investigated. Experimental results showed that the linear response of the sensor is 0.05－0.35 mg/L， the recovery of standard addition is 80% to 105% and the detection limit is 7.3

SymbolmA@ g/L. In comparison with HPLC， when the confidence level was 99%， there is no systematic error. The sensor exhibited a good selectivity and sensitivity

Keywords Microcystins; Molecular imprinting; Electricity polymerization; Sensor

（Received 30 June 2011; accepted 21 September 2011）

熱分析與量熱儀及其應(yīng)用

（第二版，ISBN 978-7-122-09689-0）