離子排斥色譜法測定生脈注射液中的有機酸

1 引 言

生脈注射液是由紅參、麥冬和五味子3種藥材經提取后制成的滅菌水溶液，為國家中藥保護品種，具有益氣養陰，復脈固脫的功效。前期的分析實驗表明，生脈注射液中含有有機酸類成分。根據生脈注射液的生產工藝和3種藥材的的化學成分研究報道，分析生脈注射液中的有機酸主要來源于五味子。五味子含有檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸等多種有機酸成分。目前，有機酸的分析方法有氣相色譜法[1]、高效液相色譜法[2]、毛細管電泳法[3]及離子色譜法[4]。這些方法專屬性差或樣品制備繁瑣，而離子排斥色譜法（IEC）樣品前處理簡單[5]，準確度高，重現性好，適合于同時定量分析多種有機酸。本研究利用離子排斥色譜法對生脈注射液中的主要水溶性有機酸進行了分析，結果穩定可靠。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑 850離子色譜儀（瑞士Metrohm公司），配備電導檢測器、英藍超濾系統、magIC Net 工作站；Sartorius BT 224S型電子天平。生脈注射液由國內4個廠家提供。檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；H2SO₄（分析純，北京化工廠）； 丙酮（色譜純，J. T. Baker USA）； 實用用水為Millipore高純水。

2.2 對照品及供試品溶液的制備 準確稱取檸檬酸119.2 mg，蘋果酸130.3 mg，琥珀酸55.5 mg，置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度得對照品儲備液，用水稀釋配成系列濃度的混合標樣；取生脈注射液2 mL于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，經0.45

SymbolmA@ m 濾膜過濾， 取續濾液。

2.3 色譜條件 Transgenomic Sep-ION-300色譜柱（300 mm×7.8 mm i.d.， 8

SymbolmA@ m）；淋洗液：5 mmol/L H2SO₄：丙酮（95∶5， V/V）；進樣體積20

SymbolmA@ L，流速0.4 mL/min，柱溫70 ℃。抑制系統：100 mmol/L LiCl。

3 結果與討論

3.1 Transgenomic Sep-ION-300色譜柱分離機理 Transgenomic Sep-ION-300色譜柱的填料是完全磺化的聚苯乙烯/二乙烯苯（ PS/DVB ）共聚物，因填料完全磺化，填料表現為帶負電荷的球體，不帶電荷的分析物可被填料吸附。這種平衡可由有機酸的酸解離常數（pKa）調節。因此，分析物按離子排斥的機理得到分離， 并按pKa的順序先后洗脫。生脈注射液中主要含有的3種有機酸： 檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸，它們的pKa值分別為3.13， 3.40和4.21，保留時間分別為13.9， 16.6和19.7 min，實驗結果與Transgenomic Sep-ION-300色譜柱的分離機理相互印證。

3.2 色譜條件的優化 本實驗分別考察了不同濃度的H2SO₄，以及不同配比的H2SO₄/Acetone等多種淋洗液。結果表明，在淋洗液中加入丙酮，可以有效改善有機酸的峰形，提高靈敏度，同時提高目標化合物檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸與雜質的分離度； 而H2SO₄和丙酮的濃度對實驗結果影響不大，因此通過幾組實驗對比，并考慮實驗時間和成本等因素，最終選用5 mmol/L H2SO₄和5% Acetone為有機酸分析的淋洗液。對柱溫也進行了考察，結果表明，選取高柱溫70 ℃有利于改善峰形，提高分離度。采用LiCl為再生液，由于Li的電導率比H低，經過抑制后，將淋洗液中的H2SO₄轉化為電導率更低的Li2SO₄，降低背景，提高靈敏度。在上述確定的色譜條件下，對照品及樣品的典型色譜圖見圖1。

圖1 有機酸對照品 （A） 和生脈注射液色譜圖 （B）

Fig．1 Chromatograms of standard solution of organic acids （A） and Sheng-mai Injection （B）

1．檸檬酸（Citric acid）；2. 蘋果酸（Malic acid）；3. 琥珀酸（Succinic acid）。

3.3 線性關系及檢出限

取適量對照品儲備液，稀釋成系列濃度的混合標樣，采用本方法測定。檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸分別在7.45～476.5 mg/L，8.14～521.0 mg/L和3.47～222.0 mg/L范圍內呈良好的線性關系；檢出限分別為0.8， 0.5和0.8 mg/L。

3.4 精密度、重復性和穩定性 取混合對照品溶液重復進樣6次，檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸峰面積RSD分別為2.3%， 1.4%和0.4%。取同一批注射液樣品，平行制備6份供試品溶液，測定含量，檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸含量的RSD分別為1.4%， 1.1%和1.3%。

取同一份供試品溶液，分別于0， 2， 8， 16和24 h進樣測定。結果表明，檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸在24 h內穩定，RSD分別為1.3%， 1.2%和2.3%。

3.5 回收率實驗 取有機酸對照品（檸檬酸122.8 mg，蘋果酸45.2 mg，琥珀酸34.8 mg），置于50 mL容量瓶中，以水定容，得對照品儲備液；取2 mL已知含量的生脈注射液9份，置于50 mL容量瓶中，分為3組，分別加入對照品儲備液2.5，3.0和3.5 mL（加入量近似為2 mL樣品中檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸含量的80%，100%和120%），加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液測定。根據測得量和加入量計算回收率。檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸的平均回收率分別為97.1%，96.9%和95.1%，RSD分別為2.7%，2.3%和1.9%。

3.6 樣品測定 分別對4個廠家15批樣品進行測定。結果表明，不同廠家3種有機酸的含量差異很大，檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸的含量分別在0.0071～4.6727 g/L，0.0608～2.1169 g/L和0.0202～0.8641 g/L之間；3種有機酸含量之和在0.0917～7.3535 g/L之間。生脈注射液中的有機酸主要來源于五味子，五味子的生產工藝為水提醇沉后活性炭煮沸過濾。不同廠家的注射液中有機酸含量差異大， 可能與各生產廠家的原料來源、處理方式以及生產工藝的不同有關。

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Determination of Organic Acids in Sheng-mai Injection by

Ion Exclusion Chromatography

LIU Rui1，2， NIE Li-Xing .2， SUN Huan.3， LI Tao.3， WANG Gang-Li*2， LIN Rui-Chao1，2

.1（Beijing University of Chinese Medicine， School of Chinese Materia Medica， Beijing 100029， China）

.2（National Institute for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

.3（Metrohm China Limited， Central Laboratory， Beijing 100005， China）

Abstract A method was developed for the separation and determination of three organic acid， viz citric acid， malic acid and succinic acid in Sheng-mai Injection by ion exclusion chromatography with suppressed conductivity detection. The chromatographic separation was performed on a Transgenomic Sep-ION-300 column （300 mm length ×7.8 mm i.d.， 8

SymbolmA@ m） at 70 ℃ and eluted with a mixture of 5 mmol/L sulphuric acid and acetone （95∶5） at the flow rate of 0.4 mL/min. The effects of the concentration of sulphuric acid， the volume ratio of acetone and column temperature were investigated and optimized. The calibration curve for citric acid， malic acid and succinic acid was in a good linearity in the range of 7.45－476.5 mg/L， 14－521.0 mg/L and 3.47－222.0 mg/L， respectively. The average recovery for citric acid， malic acid and succinic acid was 97.12% with RSD 2.7%， 96.9% with RSD 2.3%， and 95.09% with RSD 1.9%， respectively. The validated method was successfully applied to determination of organic acids in 15 batches of Sheng-mai Injection.

Keywords Ion exclusion chromatography; Organic acids; Sheng-mai injection

（Received 19 July 2011; accepted 28 September 2011）