膜基質免疫分析法同時檢測玉米中伏馬菌素B₁和嘔吐毒素

摘 要 建立了基于聚偏氟乙烯膜（Polyvinylidene fluoride， PVDF）基質的直接競爭免疫分析法，同時檢測玉米中的伏馬菌素B₁（Fumonisin B₁， FB₁）及嘔吐毒素（Deoxynivalenol， DON）。PVDF膜用甲醇浸濕、激活，用移液器將 FB₁及 DON 全抗原點陣于相應的膜反應區，同時采用三聚氰氯法和高碘酸鈉法分別制備抗FB₁、抗 DON 的辣根過氧化酶（Horseradish peroxidase， HRP）標抗體（monoclonal antibody， McAb），以直接競爭免疫檢測方法的模式實現同時檢測玉米中的 FB₁及 DON。該方法對于 FB₁和DON 的檢出限分別為 2.5和50

SymbolmA@ g/L，樣品前處理簡單，檢測時間 15 min，可肉眼辨別結果，隨機檢測了 30 份市售玉米樣品，并與市售 ELISA 試劑盒進行方法學比較，結果無明顯差異。

關鍵詞 聚偏氟乙烯膜； 伏馬菌素B₁； 嘔吐毒素； 直接競爭免疫檢測

2011-06-24收稿；2011-09-22接受

本文系國家“863”計劃項目（No. 2007AA10Z427）資助

* E-mail: xuyang1951@163.com

1 引 言

伏馬菌素（Fumonisins， FBs）是主要由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）產生的水溶性代謝產物[1]，大多存在于玉米及玉米制品中[2]。FB₁是其中的主要組分，占伏馬菌素總量的 70%～80%[3]，也是導致伏馬菌素毒性作用最主要原因。伏馬菌素具有神經毒性[4]、免疫系統毒性[5]和致癌性[6]等。瑞典已確定玉米中 FB₁和 FB2的最大可接受限量為1 mg/kg[7]，我國尚未制定食品與飼料中伏馬菌素的限量標準。

嘔吐毒素是主要由禾谷鐮刀菌（F.graminearum）和黃色鐮刀菌（F.culmorum）產生的化學結構和生物活性相似的有毒代謝產物，是一種單端孢霉烯族化合物，常污染玉米、小麥和大麥等谷物及其制品[8]，具有免疫毒性[9]、胚胎毒性[10]和細胞毒性[11]。我國規定谷物及其制品中 DON 的限量為1 mg/kg[12]。

真菌毒素的快速檢測方法主要有酶聯免疫吸附法（ELISA）[13，14]、基于 NC 膜的膠體金免疫層析法（Colloidal gold immunochromatography assay， GICA）[15，16]等。PVDF 膜具有較強的疏水性和靜電吸附作用，它對蛋白質具有極強的吸附能力，機械性比硝酸纖維素膜好，室溫下不受酸、堿等強氧化劑和鹵素等腐蝕，紫外燈照射1年，其性能基本不變[17]，故選用 PVDF 膜作為載體。本研究建立了基于 PVDF 膜基質的直接競爭免疫分析方法，可同時檢測玉米中的 FB₁ 和 DON。樣品前處理簡單，檢測時間 15 min，具有穩定性好、結果準確易于判定、經濟實用等優點，適合于大批量樣品的現場快速檢測。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Mill-Q超純水儀、PVDF膜（3.75 m×26.5 cm， 0.45

SymbolmA@ m）、超濾管（10 kDa， 美國Millipore公司）；SORVALL Blofuge stratos臺式高速冷凍離心機（德國Heraeus 公司）；WD-9405 B水平搖床（北京沃德生物醫學儀器公司）；單管可調微量移液器（0.5～10

SymbolmA@ L， 德國Eppendorf公司）； DON-cBSA 全抗原、FB₁-OVA 全抗原（本實驗室自制）；抗 DON 單克隆抗體、抗FB₁單克隆抗體（本實驗室自制）；羊抗鼠IgG-HRP酶標二抗、OTA、AFB₁、DON、FB₁、FB2、玉米赤霉烯酮（Zearalenone， ZEN）、T-2毒素（T-2）、HT-2毒素（HT-2）標準品（美國Sigma公司）；辣根過氧化物酶（上海生工）；脫脂牛奶（加拿大Bio Basic Inc.公司）；單組分 TMB 顯色液（沉淀型，湖州英創生物科技有限公司）；其它試劑均為分析純以上。

2.2 抗體的純化和酶標抗體的制備

采用辛酸-硫酸銨法[19]純化抗 FB₁ 及抗 DON 單克隆抗體腹水，并用紫外及 SDS-PAGE 電泳測定純化后抗體的濃度和純度。

采用三聚氰氯法和高碘酸鈉法分別制備抗 FB₁和抗 DON 酶標抗體[19，20]。超濾濃縮除鹽后，紫外分光光度計掃描，直接競爭 ELISA 方法確定酶標抗體的效價及特異性。

2.3 PVDF 膜基質免疫檢測裝置的制備

2.3.1 PVDF膜處理 用鉛筆在PVDF膜上畫出 5 個矩形（20 mm×9 mm），作為膜反應區，每個反應區平均分成 2份，分別作為 FB₁和 DON檢測區。將 PVDF 膜在甲醇中浸泡 15 s，再于超純水中浸泡 2 min。

2.3.2 真菌毒素全抗原的點陣及封閉 參照文獻[22]，用移液器分別將 3

SymbolmA@ L FB₁、DON 全抗原稀釋液點陣于膜反應區中，靜置10 s后放入濕盒中37 ℃孵育 2 h。5% 脫脂牛奶封閉 1 h，用 PBS 漂洗，晾干。

2.3.3 PVDF 膜組裝 將圍欄貼在晾干的膜的上方，膜的下方貼上透明寬膠帶，使整個膜處于密閉狀態。整個 PVDF 膜基質免疫檢測裝置的制備流程如圖1所示。

2.4 同時檢測兩種毒素膜基質免疫分析法的建立

2.4.1 抗原包被濃度和酶標抗體工作濃度的確定 采用棋盤滴定法[22]確定抗原的包被濃度和酶標抗體的工作濃度。FB₁-OVA、DON-cBSA全抗原用PBS稀釋為 10， 20， 50， 75和100 mg/L進行包被，酶標抗體用PBS逐級稀釋至1000， 2000， 4000， 6000， 8000， 10000， 12000 倍。用RGB-Editor和Matlab軟件計算其灰度值。

根據其灰度值，確定抗原包被濃度和酶標抗體工作濃度。

2.4.2 檢測方法 用PBS稀釋FB₁-OVA， DON-cBSA全抗原，濃度根據 2.4.1節的結果確定，按 2.3節進行組裝。向膜反應區中加入 200

SymbolmA@ L FB₁， DON 混合標準品或者樣品稀釋液，同時加入 200

SymbolmA@ L酶標抗體，酶標抗體濃度根據2.4.1節的結果確定；在室溫搖床上振蕩 10 min；傾去液體，PBS洗滌 3 次，拍干，滴加沉淀性TMB顯色液，顯色 1 min，用超純水終止。

樣品中FB₁/DON 的含量低于檢出限，則檢測區顯現藍色斑點，定義為陽性；相反，定義為陰性（圖2）。

Fig．1 Flowchart of preparation of a polyvinylidene fluoride （PVDF） membrane-based immunoassay tester

DON: Deoxynivalenol; FB₁: Fumonisin B₁; OVA: Ovalbumin.

圖2 同時檢測 FB₁和 DON 膜基質免疫分析結果示意圖

Fig．2 Sketch map of membrane-based immunoassay for simultaneous detection of FB₁ and DON

1. FB₁和DON均為陰性；2. DON為陽性，FB₁為陰性；3. FB₁為陽性，DON為陰性；4. FB₁和DON均為陽性。

1. Both FB₁ and DON negative; 2. DON positive， FB₁ negative; 3. FB₁ positive， DON negative; 4. Both FB₁ and DON positive.

2.5 樣品提取

稱取 1 g粉碎玉米樣品于 10 mL離心管，準確加入 5 mL超純水，置水平搖床，充分振蕩15 min，以4000 g離心 10 min，取上清液，用超純水稀釋 4 倍，過 0.45

SymbolmA@ m水系微膜，此時溶液為樣品稀釋液。

3 結果與討論

3.1 FB₁， DON抗體的濃度和純度的分析結果

微量紫外可見分光光度計測定純化好的抗 FB₁及抗 DON 單克隆抗體的濃度，結果分別為5.52和6.99 g/L。經SDS-PAGE電泳，純化后抗體僅出現兩條帶，一條為IgG重鏈，約為 50 kDa;另一條為輕鏈，約為 25 kDa，表明辛酸-硫酸銨法有效除去了腹水中的雜蛋白，純化比較理想。

3.2 酶標抗體

用紫外分光光度計分別掃描純化的抗FB₁單克隆抗體、抗DON 單克隆抗體、HRP和酶標抗體，其紫外吸收光譜見圖3和圖 4。與純化后的單克隆抗體的紫外吸收光譜相比，兩種方法合成的酶標記抗體在HRP 的特征吸收峰 403 nm處都出現了明顯的波峰；與HRP的紫外吸收光譜相比，兩種方法合成的酶標記抗體在260和 280 nm處的吸收峰都明顯地增高，初步判斷 HRP 與抗體已經成功連接在一起。

經直接競爭 ELISA 測定，FB₁酶標抗體的效價為 1024000，IC50＝2.5

SymbolmA@ g/L；DON 酶標抗體的效價為 704000，IC50＝70.3

SymbolmA@ g/L。FB₁酶標抗體能識別 FB₁與 FB2，而與 AFB₁，OTA，DON，ZEN，T-2和HT-2均未見交叉反應，與 FB₁和FB2的交叉反應率分別為100%和16 %；DON酶標抗體與AFB₁，OTA，ZEN，FB₁，FB2，T-2和HT-2均未見交叉反應。

3.3 PVDF膜的制備

由于PVDF膜本身是疏水的，使用前需用無水甲醇預處理，活化 PVDF 膜上帶有正電基團，使它更容易與帶負電的蛋白質結合。同時將膜放在濕潤的濾紙上，通過毛細管作用，使抗原稀釋液可以快速被膜吸收。為了保證抗原稀釋液在膜上形成均勻的斑點，采用玻璃管在膜上輕輕滾壓，除去膜與濾紙之間的氣泡。包被必須在相對濕度較高的環境下進行，若包被過程在完全干燥的環境下，會產生較高的本底。

圖3 FB₁抗體、FB₁酶標抗體和HRP的紫外吸收光譜

Fig．3 Ultraviolet absorption spectra of anti-FB₁ monoclonal antibody（McAb）， anti-FB₁ McAb-HRP and HRP

Fig．4 Ultraviolet absorption spectra of anti-DON McAb， anti-DON McAb-HRP and HRP

3.4 檢出限

由棋盤滴定法確定的FB₁-OVA和DON-cBSA 全抗原的包被濃度均為 20 mg/L。FB₁和DON 酶標抗體的工作濃度分別為 1∶6000和1∶1000。通過重復檢測標準品實驗發現，加入一系列標準品后，不顯色的FB₁和DON 的最低濃度分別是 2.5和50

SymbolmA@ g/L。

3.5 穩定性

將制備好的 PVDF 膜真空密閉保存在 4 ℃冰箱內，每隔15 d取出膜，分別檢測系列混合標準品。通過檢測結果判斷膜的保質期。

將酶標抗體用二抗儲液稀釋至工作濃度，在 4 ℃冰箱內保存，每隔 7 d在包有FB₁-OVA/DON-cBSA全抗原的酶標板上檢測。

實驗表明，本方法重復性良好，PVDF 膜可在 4 ℃真空密封保存 180 d，兩種酶標抗體用二抗儲液稀釋至工作濃度，均可在 4 ℃保存 280 d，滿足長期保存的需要。

3.6 加標實驗和玉米樣品分析

稱取 1 g 粉碎的玉米樣品，經HPLC驗證未被 FB₁和 DON 污染，分別添加 25，50，和75

SymbolmA@ g/kg FB₁， 500，1000 和1500

SymbolmA@ g/kg的DON混合標準品。按2.6節提取樣品。取 200

SymbolmA@ L 樣品稀釋液于膜反應區，用膜基質免疫分析法檢測，檢測結果與市售 ELISA 試劑盒方法的檢測結果進行對比，結果見表1。由表1可見，當添加 FB₁和DON 濃度分別高于 50和1000

SymbolmA@ g/kg時，膜上的藍色斑點消失，此時呈陽性。市售ELISA 試劑盒檢測結果與膜基質免疫分析結果一致，本方法提取玉米樣本未對檢測方法造成影響。

分別采用膜基質免疫分析法和市售 ELISA 試劑盒測定了在市場上隨機購買的 30 份玉米樣品，結果見表 2。 FB₁和 DON 的檢出限分別為 2.5和 50

SymbolmA@ g/L。在膜基質免疫分析法中，將樣品稀釋20倍，故當玉米樣品中 FB₁和 DON 濃度分別超過 50 和 1000

SymbolmA@ g/kg 時，呈陽性，不顯色。由表2可知，膜免疫分析法測定的結果與市售 ELISA 試劑盒的檢測結果基本一致。

表1 玉米樣品不同添加水平的膜基質免疫分析法及ELISA試劑盒檢測結果比較

Table 1 Comparison of the detection results of corn sample by membrane-based immunoassay and ELISA kit

添加水平

Spike level（

SymbolmA@ g/kg）FB₁DON膜基質免疫分析法

Membrane-based

immunoassayFB₁DON市售 ELISA 試劑盒ELISA kit

SymbolmA@ g/kg） FB₁DON

25500－－23.6434

501000＋＋45.1 912751500＋＋70.41491

注：“－” 表示顯色，陰性結果； “＋” 表示未顯色，陽性結果 （“－” Showing color ， negative result; “＋” No color， positive result）。

分析結果表明，本方法只需一步加樣，15 min 內即可完成玉米中的伏馬菌素B₁及嘔吐毒素檢測。方法具有穩定性好、結果準確、易于判定、經濟實用等優點，適合于大批量樣品的現場快速檢測。

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Simultaneous Detection of Fumonisin B₁ and Deoxynivalenol in Corn

Samples Using a Polyvinylidene Fluoride Membrane-based Immunoassay

KANG Min， XU Yang.， HE Qing-Hua， WANG Dan

（Sino-Germany Joint Research Institute， the State Key Laboratory of Food Science and Technology，

Nanchang University， Nanchang 330047， China）

Abstract A Polyvinylidene fluoride （PVDF） membrane-based direct competition immunoassay for simultaneous detection of fumonisin B₁ （FB₁）and deoxynivalenol （DON） in corn samples was developed. PVDF membrane was soaked and activated in methanol， and then the conjugates （FB₁-ovalbumin（OVA） and DON-cBSA） were spotted on the membrane reaction zone using the tip of dispenser. Horseradish peroxidase （HRP） was successfully coupled to anti-FB₁ monoclonal antibody （McAb） and anti-DON McAb by cyanuric chloride method and periodate method respectively. Simultaneous detection of fumonisin B₁ and deoxynivalenol in one membrane in the system was carried out under direct competition immunoassay mode. The detection limits for fumonisins B₁ and deoxynivalenol were 2.5 and 50

SymbolmA@ g/L， respectively. With very simple sample pre-treatment， a batch of extracted samples was analyzed within 15 min. The concentration and type of mycotoxins in samples were determined visibly by the naked eye. Fumonisins B₁ and deoxynivalenol in 30 corn samples were screened by the PVDF membrane-based immunoassay， the results showed no significant difference with the ELISA kit．

Keywords Polyvinylidene fluoride membrane; Fumonisins B₁; Deoxynivalenol; Direct competition immunoassay

（Received 24 June 2011; accepted 22 September 2011）