金納米粒子比色探針檢測牛奶及雞蛋中的三聚氰胺

摘 要 三聚氰胺能誘導(dǎo)金納米粒子（AuNPs）團聚，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樽仙蛩{灰色。以AuNPs作為比色探針，建立了快速檢測牛奶和雞蛋中三聚氰胺的方法。實驗優(yōu)化得最佳反應(yīng)條件為： AuNPs粒徑 13 min、pH＝7、反應(yīng)時間10 min和溫度為室溫。對樣品中常見物質(zhì)進行了干擾實驗。樣品經(jīng)10%三氯乙酸和氯仿提取、離心分離后可直接測定，本方法對牛奶和雞蛋中三聚氰胺的檢出限分別為0.1和2.5 mg/L（S/N＝3），加標(biāo)回收率分別為95.0%～105.0%和98.0%～104.0%。

關(guān)鍵詞 三聚氰胺；金納米粒子；比色；牛奶；雞蛋

2011-08-02收稿；2011-10-05接受

本文系國家自然科學(xué)基金（No.20905031）、吉林大學(xué)引進優(yōu)秀人才科研基金（No.430505010206H6）資助項目

* E-mail：zhangth@jlu.edu.cn

1 引 言

三聚氰胺（C₃H₃N6）是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，其含氮量高達66%，常被人為添加到牛奶、奶粉以及動物飼料中以虛增蛋白質(zhì)含量。三聚氰胺不是食品添加劑，它不能在體內(nèi)代謝，過多的攝入會引起腎結(jié)石[1]。因此，嚴禁在奶制品和其它食品中使用三聚氰胺。我國政府規(guī)定， 三聚氰胺在嬰幼兒奶粉和其它食品中的最大允許殘留量分別為1.0和2.5 mg/kg。目前，檢測三聚氰胺的方法主要有高效液相色譜法[2，3]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[4，5]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6，7]等。

金納米粒子（AuNPs）以獨特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于傳感器[8，9]。AuNPs具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，消光系數(shù)高，易合成。以AuNPs為探針的比色傳感器被廣泛用于檢測核酸[10]、蛋白質(zhì)[11]、病毒[12]、金屬離子[13]等。本研究采用Frens方法合成了檸檬酸根保護的AuNPs。在通常情況下，AuNPs呈分散狀態(tài)，三聚氰胺能夠誘導(dǎo)AuNPs團聚，顏色由酒紅色變?yōu)樽仙蛩{灰色。據(jù)此，本研究建立了AuNPs比色法快速檢測三聚氰胺的方法。與文獻中采用氰尿酸衍生物[14]或冠醚[15]等修飾的AuNPs為比色探針的方法相比，本方法靈敏度相對較低，但不需要繁瑣的有機合成或修飾過程，避免了引入其它物質(zhì)造成的偏差。本方法與液相色譜法[2，3]、液（氣）相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[4～7]比較，靈敏度較低，但樣品前處理簡單，不需要衍生，整個檢測過程只需要30 min，成本低，有望用于實際樣品的現(xiàn)場快速檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

PHS-3C pH計（上?？祪x儀器公司）；UV-2550紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；TECNAI F20透射電鏡（荷蘭FEI公司）；CR20B2冷凍離心機（日本Hitachi公司）。

三聚氰胺（優(yōu)級純）；乳糖、葡萄糖、氯金酸、檸檬酸鈉等（分析純）；氨基酸、肽類（酶解蛋清蛋白，主要為氨基酸和20個以內(nèi)氨基酸的肽鏈）。牛奶樣品（原料奶）、雞蛋樣品（有機食品）購于本地超市。

2.2 實驗方法

2.2.1 金納米粒子的合成 根據(jù)文獻[16，17]，合成粒徑為13和20 nm的AuNPs。將AuNPs滴于鍍有碳膜的銅網(wǎng)上，室溫晾干后，用透射電鏡（TEM）觀察其尺寸和形貌。儀器工作電壓為200 kV。

2.2.2 檢測方法的建立 在2 mL離心管內(nèi)，將450

SymbolmA@ L AuNPs溶液調(diào)至pH 7.0，并稀釋至1.45 mL，加入0.45 mL不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，室溫反應(yīng)10 min。以三聚氰胺的濃度為橫坐標(biāo)，以

SymbolDA@ A525（加入三聚氰胺前后，AuNPs在525 nm的吸光度的差值）為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

2.2.3 樣品前處理 分別取4 mL純牛奶或蛋清溶液（蛋清與水以體積比為2:1）（雞蛋中99.8％三聚氰胺在蛋清中[18]），分別加入1.2或1.5 mL 10％三氯乙酸、1.5或2 mL氯仿，渦旋振蕩1 min，超聲15 min后，混合物以13000 r/min離心10 min。取上清液過濾，用1 mol/L Na2CO₃調(diào)至pH 8.0，再以3000 r/min離心3 min，取上清液，待用。

3 結(jié)果與討論

3.1 AuNPs比色法檢測三聚氰胺

AuNPs溶液呈酒紅色（圖1A，插圖1），吸收光譜如圖1A中綠線，吸收峰在525 nm，特征吸收峰較尖銳，表明AuNPs的粒徑分布較均勻。采用TEM觀察AuNPs（圖1B），AuNPs呈規(guī)則的球形，并且粒徑均一（約為13 nm）， 分散較好。向AuNPs溶液中加入三聚氰胺后，溶液的顏色變成紫色（圖1A，插圖2），525 nm處的吸收強度降低，且在680 nm處出現(xiàn)新的吸收帶（圖1A，藍線）。圖1C證實了三聚氰胺能夠引起AuNPs發(fā)生聚集。采用三聚氰酸代替三聚氰胺進行控制實驗，三聚氰酸不能引起AuNPs的團聚，AuNPs的吸收光譜不變（圖1A，紅線）。三聚氰酸與三聚氰胺的結(jié)構(gòu)差異，表明，三聚氰胺誘導(dǎo)AuNPs團聚的主要因素為氨基基團。原因可能為，制備的AuNPs由帶負電荷的檸檬酸根保護，

圖1 （A） 吸收光譜圖， AuNPs（綠線）；AuNPs與三聚氰胺溶液（藍線）；AuNPs與三聚氰酸溶液（紅線）。插圖：照片; （B） AuNPs的透射電鏡圖；（C） AuNPs與三聚氰胺溶液混合體系透射電鏡圖。

Fig．1 （A） Absorption spectra of AuNPs in the presence of water （green line）， melamine （blue line） and cyanuric acid （red line）. （B） TEM image of AuNPs; （C） TEM image of AuNPs in the presence of melamine

靜電斥力與范德華引力相抵消，所以AuNPs分散均勻。三聚氰胺有3個氨基，氨基可以取代AuNPs表面的檸檬酸根，結(jié)合在AuNPs表面，降低了AuNPs之間的靜電斥力[19]，使AuNPs發(fā)生團聚；此外，覆蓋在AuNPs表面的三聚

圖2 AuNPs比色法快速檢測三聚氰胺的原理示意圖

Fig．2 Schematic illustration of rapid detection of melamine using AuNPs as colorimetric probe

氰胺通過間氫鍵作用（氨基之間，氨基與環(huán)上的氮原子）相互交聯(lián)，也可使AuNPs發(fā)生團聚[13]（圖2），從而引起AuNPs溶液顏色和吸收光譜發(fā)生變化。

3.2 實驗條件的優(yōu)化

3.2.1 AuNPs的粒徑對體系的影響 合成粒徑為13和20 nm的AuNPs，以吸收峰的差值為檢測信號，發(fā)現(xiàn)13 nm的AuNPs對三聚氰胺的響應(yīng)更加靈敏。原因可能是隨著粒徑的減小，AuNPs的表面能不斷增加[20]，AuNPs與三聚氰胺的結(jié)合能力不斷增強。

3.2.2 pH值對體系的影響

以乙酸緩沖溶液作介質(zhì)，用1 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)AuNPs的pH值，加入4 mg/L三聚氰胺，室溫下反應(yīng)10 min，

SymbolDA@ A525與pH值的關(guān)系如圖3所示。當(dāng)pH＝7.0時，

SymbolDA@ A525最大，原因是在強酸或者強堿的條件下，三聚氰胺會逐步失去3個氨基，轉(zhuǎn)變?yōu)槿矍杷醄13]，三聚氰酸不能誘導(dǎo)AuNPs團聚。pH＝7.0時，AuNPs溶液在525 nm處吸收值最大。本研究中采用pH＝7.0的AuNPs進行實驗。

3.2.3 反應(yīng)時間對體系的影響 將450

SymbolmA@ L 1 mg/L三聚氰胺溶液與1450

SymbolmA@ L AuNPs混合，每隔2 min掃描吸收光譜，

SymbolDA@ A525與反應(yīng)時間的關(guān)系如圖4所示。當(dāng)反應(yīng)時間達到10 min時，溶液顏色不再變化，

SymbolDA@ A525趨于平穩(wěn)，三聚氰胺誘導(dǎo)AuNPs團聚達到飽和。因此，選擇反應(yīng)時間為10 min。

圖3 pH值對體系

SymbolDA@ A525的影響

Fig．3 Effect of different pH values of AuNPs on

SymbolDA@ A525

SymbolDA@ A525的影響

Fig．4 Variation curve of

SymbolDA@ A525 with different reaction time

3.2.4 溫度對體系的影響 將450

SymbolmA@ L 1 mg/L三聚氰胺溶液與1450

SymbolmA@ L AuNPs混合，分別在10， 20， 30， 40， 50和60 ℃下反應(yīng)10 min。結(jié)果表明，10 ℃時溶液顏色幾乎不發(fā)生變化，反應(yīng)進行緩慢；而溫度在20～60 ℃時，溶液顏色的變化基本一致。溫度較高時，AuNPs可能發(fā)生自團聚，本實驗選擇在室溫下進行。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液加入AuNPs溶液中，按2.2.2節(jié)的方法進行實驗。隨著三聚氰胺濃度的增大，AuNPs在525 nm處的吸收強度逐漸降低，在長波方向出現(xiàn)新的吸收帶，其強度逐漸增強（圖5）。 圖5 不同濃度三聚氰胺存在時AuNPs的吸收光譜，三聚氰胺的濃度（箭頭方向）依次為0， 0.1， 0.5， 2.0， 3.0和4.0 mg/L， 插圖為三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Fig．5 Absorption spectra of AuNPs in the presence of different concentrations of melamine. The concentrations of melamine （in arrowhead direction） are 0， 0.1， 0.5， 2.0， 3.0， 4.0 mg/L， respectively. The inset is the calibration plot of 

SymbolDA@ A525 versus melamine concentration.當(dāng)三聚氰胺的濃度在0.10～4.0 mg/L范圍內(nèi)時，

SymbolDA@ A525與三聚氰胺的濃度呈良好的線性關(guān)系（r＝0.99），方法的檢出限為0.01 mg/L（S/N＝3）。

3.4 干擾實驗

為了將本方法用于實際樣品的檢測，考察了食品中可能出現(xiàn)的物質(zhì)對AuNPs穩(wěn)定性的影響。實驗中三聚氰胺的濃度為4 mg/L，氨基酸和肽類濃度為1.2 g/L，其它物質(zhì)濃度均為200

SymbolmA@ mol/L。實驗結(jié)果如圖6所示，干擾物質(zhì)不能引起AuNPs團聚。同時，實驗了相同濃度的干擾物質(zhì)對三聚氰胺誘導(dǎo)AuNPs團聚的影響。結(jié)果表明，這些物質(zhì)的存在不會干擾AuNPs比色法檢測三聚氰胺。

3.5 實際樣品檢測

在牛奶和雞蛋樣品中加入不同濃度的三聚氰胺，按照2.2.3節(jié)進行樣品前處理。準(zhǔn)確吸取450

SymbolmA@ L樣品提取液，加入到1450

SymbolmA@ L AuNPs中，光譜分析結(jié)果如圖7所示。當(dāng)牛奶中三聚氰胺的濃度在2～40 mg/L范圍內(nèi)時，

SymbolDA@ A525與三聚氰胺的濃度呈良好的線性關(guān)系（r＝0.99，圖7A插圖），方法的檢出限為0.1 mg/L（S/N＝3）。當(dāng)雞蛋中三聚氰胺的濃度在5～50 mg/L范圍內(nèi)時，

SymbolDA@ A525與三聚氰胺的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r＝0.99，圖7B插圖），方法的檢出限為2.5 mg/L（S/N＝3）。當(dāng)牛奶中三聚氰胺的含量高于8 mg/L，雞蛋中三聚氰胺的含量高于10 mg/L時，不需要借助儀器，通過肉眼即可觀察到顏色變化。比較圖7和圖5，在牛奶、雞蛋提取液和水中，三聚氰胺誘導(dǎo)AuNPs的吸收光譜變化略有不同。

圖6 不同物質(zhì)存在時AuNPs的吸收光譜 （A）和體系的

SymbolDA@ A525值 （B）

Fig．6 （A） Absorption spectra of AuNPs in the presence of different analytes. （B）

SymbolDA@ A525 of Au NPs solution in the presence of different analytes

1. 三聚氰胺；2. NaCl; 3. CaCl2; 4. （NH₄）2SO₄; 5. KNO₃; 6. Vc; 7. 葡萄糖； 8. 乳糖； 9. 氨基酸及肽類。

1. Melamine; 2. NaCl; 3. CaCl2; 4. （NH₄）2SO₄; 5. KNO₃; 6. Vitamin C; 7. Glucose; 8. Lactose; 9. Amino acid and peptides.

圖7 牛奶（A）和雞蛋（B）中加入不同濃度三聚氰胺時體系的吸收光譜。插圖為相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線

Fig．7 Absorption spectra of Au NPs with different concentrations of melamine spiked in milk （A） and eggs （B）

牛奶中三聚氰胺的濃度依次為0， 2， 10， 20， 30和40 mg/L。雞蛋中三聚氰胺的濃度依次為0， 5， 10， 20， 30和50 mg/L（從上至下）

The insets the corresponding calibration plots of

SymbolDA@ A525 versus spiked melamine concentration. The concentrations of melamine in milk are 0， 2， 10， 20， 30， 40 mg/L. The concentrations of melamine in eggs are 0， 5， 10， 20， 30， 50 mg/L （up to down）.這可能是由于樣品提取液中存在的少量氨基酸導(dǎo)致的[21]。在牛奶和雞蛋中加入不同濃度的三聚氰胺，測其回收率，結(jié)果如表1所示，回收率分別為95.0％～105.0％和98.0%～104.0％。本方法操作簡便、分析時間短、不需要精密復(fù)雜的儀器設(shè)備、檢測成本低，適用于食品中三聚氰胺的現(xiàn)場快速檢測。

表1 標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測牛奶， 雞蛋中的三聚氰胺

Table 1 Determination of melamine in milk and egg samples spiked with different amounts of melamine by this method

樣品

Sample編號No.加入量Added（mg/L）測得量Found（mg/L）回收率Recovery（%）RSD（%，

n＝3）樣品

Sample編號No.加入量Added（mg/L）測得量Found（mg/L）回收率Recovery（%）RSD（%，

n＝3）

牛奶

Milk187.6952.6

21515.81053.133030.51024.4雞蛋1109.8982.622020.11013.233031.21044.7

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Gold Nanoparticles-based Colorimetric Sensing

of Melamine in Milk and Eggs

SUN Chun-Yan， ZHANG Min-Wei， LI Hong-Kun， Li Yan-Song， PING Hong， GUO Jia-Jia， ZHANG Tie-Hua.*

（College of Quartermaster Technology， Jilin University， Changchun 130062， China）

Abstract Melamine could rapidly induce the aggregation of gold nanoparticles （AuNPs）， thereby resulting in red-to-purple （even blue） color change. Thus， a rapid detection method for melamine in milk and eggs using AuNPs as colorimetric probe has been established. The experimental conditions was optimized in detail， ultimately， the analysis was carried out using 13 nm AuNPs in the media of pH 7， and the reaction was perfomed for 10 min at room temperature. Moreover， the effects of interfering substances in the samples were investigated. The melamine can be detected after extraction and centrifugation separation with 10％ trichloroacetic acid and chloroform. The proposed method could be used to detect melamine in milk and eggs with a detection limit of 0.1 mg/L， 2.5 mg/L （S/N＝3）， and the recovery are 95.0%－105.0%， 98.0%－104.0% respectively.

Keywords Melamine; Gold nanoparticles; Colorimetric; Milk; Eggs

（Received 2 August 2011; accepted 5 October 2011）