超聲輔助提取高效液相色譜法檢測小麥籽粒中殺雄嗪酸的殘留

摘 要 建立了高效液相色譜法（HPLC）檢測小麥籽粒中化學雜交劑SQ-1主成分殺雄嗪酸殘留的方法。以75%乙醇為提取劑，正反萃取凈化；采用Diamonsil C18不銹鋼柱，以甲醇-0.5% （NH₄）2HPO₄溶液（60∶40，V/V， pH 2.5）為流動相，檢測波長283 nm，流速1.0 mL/min。結果表明：化學雜交劑SQ-1主成分殺雄嗪酸在0.75～25.0 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數r＝0.9999，在3個添加水平（1.0， 5.0和10.0 mg/kg）范圍內，平均加標回收率在84.2%～95.0%之間，相對標準偏差為1.0%～3.3%，檢出限為0.075 mg/L。

關鍵詞 小麥； 高效液相色譜； 正反萃取； 化學雜交劑SQ-1; 殺雄嗪酸

2011-07-23收稿：2011-09-22接受

本文系國家“863”計劃重大專項（Nos. 2009AA101102，2011AA10A106）、國家自然科學基金項目（Nos. 31071477，31171611）、高等學校博士學科點專項科研基金（No. 20090204110024）和陜西省“13115”科技創新工程重大科技專項（No. 2014ZDKG-08）資助

* E-mail：zhanggsh@public.xa.sn.cn

1 引 言

小麥化學雜交劑誘導的生理型雄性不育，在生產上具有配制組合自由、省時、省力等優點，是目前小麥化控“兩系法”雜種優勢利用的主要途徑[1～4]。SQ-1是我國自行研制的具有自主知識產權的一種新型小麥化學雜交劑，主要化學成分為殺雄嗪酸。它具有殺雄效果徹底、對小麥無任何不良影響和施藥期較長等優點，在小麥上經多年大面積制種實踐有著很好的殺雄效果，可誘導小麥殺雄率達到95%～100%，異交結實率超過85%，目前已在生產制種中得到廣泛應用，使化控二系小麥雜種優勢利用率先走向了大面積生產[5～8]。但小麥化學雜交劑噴施后，收獲的F2種子（食用商品糧）中是否存在殺雄嗪酸的殘留，對其安全應用十分重要。然而，目前有關本領域研究很少有報道。

在農藥殘留分析中經常使用的檢測方法有氣相色譜法（GC）[9，10]、高效液相色譜法（HPLC）[11]、氣相色譜-質譜法（GC/MS）[12，13]、液相色譜-質譜法（LC/MS）[14]、薄層色譜法（TLC）、超臨界流體色譜法（SFC）、毛細管電泳法（CE）[15]和酶聯免疫吸附測定法（ELISA）[16，17]等。本研究采用超聲波輔助提取，正反萃取凈化，高效液相色譜法檢測殺雄嗪酸在小麥籽粒中的含量。結果表明，本方法凈化效果好，回收效率和靈敏度高，且操作步驟簡單，檢測成本低，不僅可用于檢測化學雜交劑SQ-1主成分殺雄嗪酸殘留量，還為小麥化控兩系雜種優勢利用提供了有力的技術支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（Waters公司），配2487雙通道紫外檢測器；Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4. 6 mm， 5

SymbolmA@ m）； Electron Evolution 300紫外分光光度計（Thermo公司）；上海亞榮-RE52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA A11 basic分析用研磨機（廣州儀科實驗技術有限公司）；Milli-Q Biocel超純水機（美國Milli-poreco公司）；SK-1快速混勻器（常州國華電器）；甲醇（色譜純）；乙醇、乙腈、乙醚、二甲苯、正己烷、乙酸乙酯、氯仿，殺雄嗪酸標準品由陜西省作物雜種優勢研究與利用重點實驗室提供。

2.2 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4. 6 mm， 5

SymbolmA@ m）；流動相：甲醇-0.5% （NH₄）2HPO₄溶液（60∶40，V/V， pH 2.5）；檢測波長為283 nm；流速 1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量 10

SymbolmA@ L。

2.3 樣品前處理

稱取勻質化后的小麥樣品西雜5號親本Mp02， Fp02和后代F2（食用商品糧）2 g于50 mL離心管中，加入10 mL 75% 乙醇，超聲提取10 min，然后過濾上清液（提取3次），合并濾液。將濾液旋轉蒸發至近干，用超純水定容至5 mL，調節至pH 2.5，加入乙酸乙酯5 mL，劇烈振蕩1 min，靜置10 min，待有機相和水相分層后，取有機相，重復上述萃取步驟，合并有機相。在有機相中加入1 0mL NaOH溶液，劇烈振蕩1 min，靜置10 min，待有機相和水相分層后，取水相，重復上述反萃取步驟，然后合并水相，旋轉蒸發至近干，用超純水定容至5 mL，過0.45

SymbolmA@ m濾膜，待測。

3 結果與討論

3.1 色譜分析條件的優化

3.1.1 波長的選擇 紫外分光光度法一般根據待測組分的吸收光譜，選擇最大吸收波長λmax作為測定波長，靈敏度最高，同時吸光度隨波長的變化最小，可以得到較好的測定精度。但在實際工作中并不一定選擇λmax，如待測組分的λmax受到共存的雜質干擾，可以選擇其它吸收峰的波長進行測定（特征波長）。利用紫外分光光度計對化學雜交劑SQ-1主成分殺雄嗪酸進行全波長掃描，確定檢測波長為283 nm。此波長為特征波長，兼顧了靈敏度和抗干擾性（圖1）。

圖1 殺雄嗪酸紫外吸收光譜譜圖

Fig．1 Ultraviolet spectrum of clofencet

3.1.2 流動相的選擇 研究了不同配比的甲醇-水溶液、甲醇-H₃PO₄溶液（pH 2.5）、甲醇-0.5% （NH₄）2HPO₄水溶液（H₃PO₄調至pH 2.5）及甲醇-0.5% （NH₄）2HPO₄溶液（H₃PO₄調至pH 6.5）作為流動相。結果表明，在流動相為甲醇-水溶液時，隨著流動相中甲醇含量的增加，殺雄嗪酸的保留時間逐漸減少，但是峰型有些拖尾；殺雄嗪酸為酸性噠嗪類化合物，調節pH值可以抑制拖尾; 當pH＝6.5時，盡管峰型對稱，但是分離度不好；當流動相為甲醇-0.5% （NH₄）2HPO₄溶液（60∶40，V/V， 以H₃PO₄調至pH 2.5）時，殺雄嗪酸峰型對稱，分離度好。

3.2 提取條件的優化

3.2.1 樣品提取劑的選擇 考察了甲醇、乙醇、乙腈、75%甲醇和75%乙醇作為提取劑的效果。結果表明，甲醇、乙醇、乙腈作為提取劑時，乙腈提取率稍高，但是差異不顯著；75%甲醇和75%乙醇作為提取劑時，75%乙醇提取率比較高；由于乙腈不但價格高，而且毒性較大，綜合考慮，采用75%乙醇作為提取劑。

3.2.2 樣品提取方式的選擇 分別研究了靜止浸泡（30 min）、振蕩（30 min）、超聲波（3次，每次10 min）3種提取方式對殺雄嗪酸提取率的影響。結果表明：超聲提取（功率300 W， 溫度30 ℃）的提取率比較高，因此采用超聲波輔助提取作為提取方式。

3.3 凈化方法的優化

3.3.1 萃取溶劑的選擇 分別以正己烷、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯和氯仿為萃取劑，其萃取率分別為47.3%， 93.2%， 94.7%， 98.4%和96.1%。乙酸乙酯的萃取率最高，正己烷的萃取率最低。由于殺雄嗪酸的極性大，易溶于乙酸乙酯，因此采用乙酸乙酯作為萃取劑。

3.3.2 萃取次數的選擇 實驗中分別研究了萃取1～5次對萃取率的影響，結果表明：萃取1次的萃取率比較低，萃取2～5次的萃取率高，但差異不顯著。隨著萃取次數的增加，凈化時間也隨之增加，綜合考慮采用2次萃取。

3.3.3 萃取時水相pH值的選擇 分別考察了水相pH值為2.0， 2.5， 3.0， 3.5， 4.0時的萃取效果，結果表明：隨著pH值的升高，萃取率降低（圖2），溶液的pH值較低時，殺雄嗪酸主要以分子形式存在，有利于向有機相擴散。pH＜2.5時，萃取率變化不大，所以選擇pH值為2.5。

3.3.4 反萃取劑類型的選擇 研究了反萃取劑為NaOH， Na2CO₃， NaHCO₃溶液時對殺雄嗪酸提取率的影響，結果表明：反萃取劑為NaHCO₃溶液時，提取率最低，峰型不對稱；反萃取劑為NaOH時，提取率最高，峰型對稱，因此選擇NaOH作為反萃取劑。

3.3.5 反萃取相pH值的選擇 實驗中分別考察了反萃取劑pH值（10， 11， 11.5， 12， 12.5）對殺雄嗪酸反萃取率的影響。結果表明，隨著反萃取劑pH值的升高，反萃取率增大（圖3）;反萃取劑pH＞12時，反萃取率變化不大，因此選擇反萃取劑pH＝12。

Fig．2 Effect of pH in aqueous phase on extraction efficiency

Fig．3 Effect of pH in aqueous phase on stripping

3.4 線性范圍、檢出限、回收率和精密度 將殺雄嗪酸標準品用水配制成系列濃度的溶液，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積對溶液質量濃度進行線性回歸，得回歸方程y＝23914x

Symbolm@@ 839.58，相關系數r＝0.9999，線性范圍為0.75～25.0 mg/L; 在信噪比（S/N）為3時，檢出限為0.075 mg/L。 圖4 殺雄嗪酸色譜圖

Fig．4 Chromatograms of clofencet

A: 小麥化學雜交劑SQ-1標準品（SQ-1 standard）； B: 小麥空白樣品（Blank wheat sample）； C: 小麥添加樣品（piked wheat sample）。

在2 g粉碎的小麥空白樣品中，添加3個水平的殺雄嗪酸標準品，進行添加回收實驗。3個添加水平為1.0， 5.0和10.0 mg/L，按2.2節色譜條件和2.3節樣品前處理方法進行測定，每個樣品重復處理6次，平均加標回收率分別為84.2%，95.0%和86.7%；相對標準偏差（RSD）分別為3.2%，3.3%和1.0%。本方法的準確度和精密度良好，符合農藥殘留檢測標準。空白小麥樣品添加回收率的色譜圖見圖4。

3.5 實際樣品分析

將雜交小麥西雜5號父母本（Mp02和Fp02）和后代F2（商品糧）小麥籽粒（1000 g）粉碎，采用本方法進行測定。結果表明：西雜5號父母本（Mp02和Fp02）和后代（F2）均未檢測到殺雄嗪酸殘留。

References

1 WANG Jun-Sheng， YUAN Lei， ZHANG Ming-Zhu， ZHANG Gai-Sheng， NIU Na， MA Shou-Cai， LI Hong-Xia. Journal of Agricultural Biotechnology， 2010， 18（4）: 695～701

王俊生， 袁 蕾， 張明珠， 張改生， 牛 娜， 馬守才， 李紅霞. 農業生物技術學報， 2010， 18（4）: 695～701

2 Kempe K， Gils M. Mol Breeding， 2011， 27: 417～437

3 YE Jing-Xiu， ZHANG Gai-Sheng， WANG Shu-Ping， CHEN Rui-Hong， WANG Jun-Sheng， NIU Na， MA Shou-Cai， LI Hong-Xia， ZHU Jian-Chu. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 2009， 25（10）: 949～957

葉景秀， 張改生， 王書平， 陳蕊紅， 王俊生， 牛 娜， 馬守才， 李紅霞， 朱建楚. 中國生物化學與分子生物學報， 2009， 25（10）: 949～957

4 Chakraborty K， Devakumar C. Euphytica， 2006， 147（3）: 329～335

5 Patricio C. Parodi， Maria de los Angeles Gaju. Cien. Inv. Agr.， 2009， 36（2）: 267～276

6 WANG Jun-Sheng， ZHANG Gai-Sheng， YUAN Lei， ZHANG Ming-Zhu， NIU Na， MA Shou-Cai， YE Jing-Xiu. Acta Bot. Boreal. -Occident. Sin.， 2009， 29（7）: 1351～1357

王俊生， 張改生， 原 蕾， 張明珠， 牛 娜， 馬守才， 葉景秀. 西北植物學報， 2009， 29（7）: 1351～1357

7 LIU Wei， CHEN Rui-Hong， ZHANG Gai-Sheng， NIU Na. Hereditas， 2008， 30（8）: 1063～1068

劉 衛， 陳蕊紅， 張改生， 牛 娜. 遺傳，2008， 30（8）: 1063～1068

8 Dubus I G， Barriuso E， Calvet R. Chemosphere， 2001， 45（6-7）: 767～774

9 ZHU Li-Ping， ZHU Tao， PAN Yu-Xiang， SUN Jun， DONG Jing. Chinese J. Anal. Chem.， 2008， 36（7）: 107～112

朱莉萍， 朱 濤， 潘玉香， 孫 軍， 董 靜. 分析化學， 2008， 36（7）: 107～112

10 WANG Jian-Hua， ZHANG Yi-Bing， TANG Zhi-Xu， LIU Xin-Tong. Journal of Instrumental Analysis， 2005， 24（1）： 100～102

王建華， 張藝兵， 湯志旭， 劉心同. 分析測試學報， 2005， 24（1）： 100～102

11 Farhadi K， Matin A A， Hashemi P. Chromatographia， 2009， 69: 45～49

12 ZHUANG Wan-E， GONG Zhen-Bin， YE Jiang-Lei， CHEN Deng-Yun. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（6）： 811～816

莊婉娥， 弓振斌， 葉江雷， 陳登云. 分析化學， 2010， 38（6）： 811～816

13 Lesueur C， Knittl P， Gartner M， Mentler A， Fuerhacker M. Food Control.， 2008， 19: 906～914

14 Koesukwiwat U， Sanguankaew K， Leepipatpiboon N. Anal. Chim. Acta， 2008， 626（1）: 10～20

15 LI Li-Jun， FENG Jun， CHENG Hao， CHEN Qi-Feng， ZHONG Zhao-Heng， KONG Hong-Xing， WU Jian-Ling. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（3）: 401～405

李利軍， 馮 軍， 程 昊， 陳其鋒， 鐘招亨， 孔紅星， 吳健玲. 分析化學， 2007， 35（3）: 401～405

16 LI Yong-Xiang， XU Zhen-Jiang， WANG Hong， LEI Hong-Tao， SUN Yuan-Ming， SHEN Dan， YANG Jin-Yi， SHEN Yu-Dong. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（11）： 1550～1555

李永祥， 徐振江， 王 弘， 雷紅濤， 孫遠明， 沈 丹， 楊金易， 沈玉棟. 分析化學， 2010， 38（11）： 1550～1555

17 WANG Shou-Fa， KAN Chun-Yue， XU Xue-Shu. Food Science， 2009， 30（23）: 489～492

王守法， 闞春月， 許學書. 食品科學， 2009， 30（23）: 489～492

Determination of Clofencet in Wheat Using Ultrasound-Assisted

Extraction by High Performance Liquid Chromatography

ZHU Qi-Di.1， ZHANG Gai-Sheng*2， ZHAO Xi-Liang1，2， ZHANG Xin-Bo.1， YANG Shu-Ling.1

.1（Northwest Agriculture and Forestry University， Wheat Breeding Engineering Research Center，

Ministry of Education， Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province， Yangling 712100， China）

.2（College of Life Science and Technology， Henan College of Science and Technology， Xinxiang 453003， China）

Abstract A method for the determination of the clofencet of chemical hybridizing agent SQ-1 in wheat has been established by high performance liquid chromatography. SQ-1 was extracted with 75% of ethanol and cleaned up by extraction and stripping technique. Diamonsil C18 column with the mobile phase consisted of methanol-water （60∶40， V/V， including 0.5% ammonium hydrogen phosphate， pH 2.5） at a flow rate of 1.0 mL/min was used for the detection at wavelength of 283 nm. A good linear relationship was obtained in the range of 0.75－25.0 mg/L with the correlation coefficient 0.9999. The average recoveries of SQ-1 were 84.2%－95.0%， the RSD were 1.0%－3.3%， and the detection limit was 0.075 mg/L.

Keywords Wheat; High performance liquid chromatography; Extraction and stripping; Chemical hybridizing agent SQ-1

（Received 23 July 2011; accepted 22 September 2011）