超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產調味品中的羅丹明B、結晶紫和孔雀石綠

1 引 言

羅丹明B常被違法用于調味品的染色，孔雀石綠和結晶紫因具有消毒和殺菌作用而常被違法應用于水產品養殖中。三者結構類似，都具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點，色譜分離較難，且由于食品基質復雜，對質譜檢測影響較大。目前，單獨檢測3種物質的方法分別有高效液相色譜法[1]、氣相色譜-質譜法[2]、液相色譜-質譜法[3]和液相色譜-串聯質譜法[4]，未見有應用固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法對復雜食品基質中上述3種物質同時測定的報道。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料 超高效液相色譜-串聯質譜儀（ACQUITY UPLC-Quattro Premier XE， Waters公司）。色譜柱: Acquity UPLCTM BEH C18柱（50 mm×2.1 mm， 1.7

SymbolmA@ m，Waters公司）；固相萃取柱（OASIS MCX， 60 mg/3 mL， Waters公司）。羅丹明B、結晶紫、孔雀石綠（Sigma公司），用乙腈（色譜純，Fisher公司）配制成標準溶液。

2.2 色譜-質譜條件 流動相A為乙腈，B為0.2%甲酸溶液，流速為0.2 mL/min；進樣量：10

SymbolmA@ L；柱溫: 35 ℃，梯度洗脫: 0～1 min， 30%～40% A; 1～2 min， 40%～50% A; 2～3 min， 50%～70% A; 3～5 min， 70%～90% A; 5～6 min， 90%～70% A; 6～7 min， 70%～30% A。電噴霧離子源正離子多反應監測，毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h。其它質譜參數見表1。

孔雀石綠Malachite329313.*208603834 * 定量離子對（Quantification ion pair）。

2.3 提取 稱取勻漿后的水產品配料調味醬2 g于具塞離心管中，依次加人1 mL 20%鹽酸羥胺，1 mL 0.1 mol/L對甲苯磺酸，2.5 mL 0.1 mol/L乙酸銨緩沖溶液和12 mL乙腈，漩渦振蕩提取5 min，低溫（5 ℃） 10000 r/min離心5 min。上清液移至另一離心管中，將殘渣搗碎，用12 mL乙腈重復提取，合并上清液；加入5 g中性氧化鋁，漩渦振蕩提取5 min后，低溫（5 ℃） 1

SymboltB@ 104 r/min離心5 min，上清液轉移至分液漏斗中，加人15 mL二氯甲烷，10 mL水，振搖2 min，靜置分層，收集下層有機層，再用10 mL二氯甲烷萃取一次，合并有機相于40 ℃旋轉蒸發近干。

2.4 凈化 依次用甲醇、0.2%甲酸各3 mL活化MCX 固相萃取柱，提取物用6 mL乙腈溶解后過柱，柱流速低于1 mL/min。再用 3 mL 0.2%甲酸，3 mL 50%甲醇淋洗，最后用 3 mL 10%氨水-甲醇溶液洗脫，洗脫液于40 ℃旋轉蒸發近干，殘留物用1 mL流動相定容，經0.2

SymbolmA@ m濾膜過濾， 供超高效液相色譜-串聯質譜測定。

3 結果與討論

3.1 超高效液相色譜條件的優化 研究了水-甲醇和水-乙腈兩種體系中水相及有機相比、添加物的種類（甲酸和乙酸胺）及添加比例對目標物分離的影響。結果表明，選用乙腈-0.2%甲酸做流動相時，3種染料有較好的分離度，且色譜峰峰型良好，混合標準溶液的MRM及總離子流色譜圖見圖1。

SymbolmA@ g/L）MRM、總離子流色譜圖

Fig．1 Multiple reaction monitoring，total ion curren chromatograms of Rhodamine B，crystal violet and malachite standard solution（10

SymbolmA@ g/L）

3.2 方法檢出限和定量限 對3種物質混合標準溶液在5

SymboltB@ 10

Symbolm@@ 4 ～1.0 mg/L濃度范圍內進行分析， 線性相關系數r≥0.997。在空白樣品中添加目標化合物，測得該方法的檢出限為0.18～0.48

SymbolmA@ g/kg。

3.3 回收率、精密度及實際樣品測定

在空白水產調味品中添加不同濃度（5.0， 20.0和100.0

SymbolmA@ g/kg）的標準溶液，測得平均回收率分別為羅丹明B 90.7%～96.8%、結晶紫78.4%～90.3%、孔雀石綠78.6%～88.9%；日內相對標準偏差均＜10%，日間相對標準偏差均＜15%。用本方法對10份水產調味品樣品進行檢測， 其中一份樣品中羅丹明B呈陽性。

References

1 Rushing L G， Hansen J E B. J. Chromatogr. B， 1997， 700（1-2）: 223～231

2 Doerge D R， Churchwell M I， Rushing L G， Bajic S. Rapid Commun Mass Spectrom.， 1995， 10: 1479～1484

3 Lee K C， Wu J L， Cai Z W. J. Chromatogr. B， 2006， 843（2）: 247～251

4 Hurtaud-Pessel D， Couedor P， Verdon E. J. Chromatogr. A， 2011， 1218（12）: 1632～1645

Simultaneous Determination of Rhodamine B，Crystal Violet

and Malachite in Aquatic Flavourings by Solid-phase

Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid

Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Zhen-Li1，2， ZHANG Pin.1， SHEN Da-Zhong*1

.1（College of Chemistry， Chemical Engineering and Materials Science， Shandong Normal University， Jinan 250014， China）

.2（Zibo Institute of Product Quality Supervision Inspection， Zibo 255033， China）

Abstract A method was developed for the simultaneous determination of rhodamine B， crystal violet and malachite in aquatic flavourings based on solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The samples were extracted with acetonitrile-buffer， partitioned against methylene dichloride and then cleaned up by a solid phase extraction cartridge. The target analytes were separated on a BEH C18 column with gradient elution using acetonitrile and water （containing 0.2% （V/V） formic acid） as mobile phases. The linear ranges were from 5×10

Symbolm@@ 4 to 1 mg/L with the limits of detection of 0.18－0.48

SymbolmA@ g/kg. The recoveries of the method were 90.7%－96.8%， 78.4%－90.3%， 78.6%－88.9%， respectively.

Keywords Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Solid-phase extraction; Rhodamine B; Crystal violet; Malachite; Aquatic flavourings

（Received 15 September 2011; accepted 3 November 2011）