分子內裂G-四鏈體脫氧核糖核酸酶用于Hg²⁺的特異性定量檢測

摘 要 G-四鏈體DNA酶是由核酸G-四鏈體與氯化血紅素（Hemin）結合后形成的一種具有過氧化物酶活性的人工酶，利用這種DNA酶，可進行多種化學及生物傳感器的設計。為提高G-四鏈體DNA酶類Hg2＋傳感器的選擇性，本研究在傳感器的設計過程中引入了分子內裂分G-四鏈體，即將形成G-四鏈體的富G序列拆分成兩部分，分別放置在Hg2＋探測序列的兩端。在無Hg2＋存在時，部分富G序列被包埋在某一分子內二倍體結構中，無法形成G-四鏈體。而在Hg2＋存在下，Hg2＋對T-T堿基錯配的穩定能力可以促使Hg2＋探測序列形成分子內二倍體結構，并伴隨著原有分子間二倍體結構的破壞及分子內裂分G-四鏈體的生成。利用生成的裂分G-四鏈體與Hemin作用后檢測體系酶活性的提高，實現Hg2＋傳感器的設計。利用該傳感器，可在50～500 nmol/L及2.0～7.5

SymbolmA@ mol/L兩個濃度范圍內實現Hg2＋的定量檢測，檢出限為47 nmol/L。由于裂分G-四鏈體DNA酶的使用強化了傳感器對Hg2＋的依賴性，極大地提高了設計的Hg2＋傳感器的選擇性。對實際水樣的加標回收結果顯示，回收率為97.5%～104.5%，證明此傳感器可以滿足實際水樣中痕量Hg2＋的分析要求。

關鍵詞 脫氧核糖核酸酶; 裂分G-四鏈體; 傳感器; 汞

2011-07-27收稿；2011-10-27接受

本文系國家自然科學基金（No. 20975055）和973項目（No. 2011CB707700）資助

* E-mail:kongdem@nankai.edu.cn

1 引 言

G-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基G的DNA或RNA序列形成的一種特殊的核酸二級結構[1]。G-四鏈體DNA酶則是由G-四鏈體與氯化血紅素（Hemin）結合后形成的具有過氧化物酶活性的DNA酶[2，3]。與一些天然的過氧化物酶相比，G-四鏈體DNA酶具有價廉，易于制備、儲存，易于修飾及水解穩定性和熱穩定性好等優勢。近年來，利用這類DNA酶，已設計了多種化學及生物傳感器，包括核酸傳感器、金屬離子傳感器及適配體傳感器等[4～19]。

汞是一種常見的環境污染物。汞的污染極大地威脅著人類的健康，它可以引起腦部、腎臟損傷及多種認知和行動的紊亂。借助于G-四鏈體DNA酶，本課題組設計了一種Hg2＋傳感器[20]。本方法利用Hg2＋存在下富G的DNA鏈從分子間二倍體結構向G-四鏈體結構的轉化，以及隨之所引起的檢測體系酶活性的提高。雖然該傳感器設計方案可以很容易地延伸用于多種金屬離子及適配體底物的測定，但僅就Hg2＋檢測而言，所面臨的問題是少數幾種金屬離子（如Ni2＋， Co2＋， Cd2＋和Pb2＋）的存在會干擾Hg2＋的檢測，尤其是Pb2＋的干擾，即使是在加入掩蔽劑PDCA（吡啶-2，6-二羧酸）時也無法消除。究其原因，Pb2＋對G-四鏈體的超強穩定能力導致其對檢測體系中二倍體和G-四鏈體兩種構型的平衡產生了嚴重的影響。Pb2＋的離子半徑略小于K＋，同K＋一樣，Pb2＋也可以進入到G-四鏈體的兩個G-四分體平面中間，并對G-四鏈體結構起到穩定作用。相比于K＋穩定下的G-四鏈體，Pb2＋穩定下的G-四鏈體結構更加緊湊、穩定性更高。即Pb2＋對G-四鏈體的穩定能力更強[21]。若上述Hg2＋檢測體系中存在Pb2＋，由于Pb2＋推動二倍體G-四鏈體平衡向G-四鏈體方向移動，將會導致體系酶活性提高，進而產生正干擾。為了消除Pb2＋等的干擾，本研究對前述Hg2＋傳感器的設計進行了改進，即將形成G-四鏈體的富G序列拆分成了兩段，而將Hg2＋探測序列插入這兩段富G序列中間。只有當Hg2＋探測序列在Hg2＋的存在下進行適當折疊后，兩段富G序列才能相互接近，進而折疊成分子內的裂分G-四鏈體DNA酶。這樣的探針設計可以增加G-四鏈體結構的形成對Hg2＋的依賴性，進而減弱甚至消除Pb2＋的干擾。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），配有微量池架；40

SymbolmA@ L的微量石英比色池（England，Starna Brand）；Jasco J-820分光偏振器。

實驗中所用到的寡核苷酸鏈均從上海生工生物技術有限公司定制合成。其濃度以單鏈濃度的形式表示，通過測量260 nm處的吸光度值除以相應的摩爾吸光系數計算得到[22]。每條寡核苷酸鏈的摩爾吸光系數由以下網站上提供的軟件計算得出（http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer）。配制的儲備液于

Symbolm@@ 20 ℃下分裝保存。TritonX-100，氯化血紅素（Hemin），三羥甲基氨基甲烷 （Tris），HAc，KAc，ABTS（2，2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽），H2O2，二甲亞砜（DMSO），Hg（Ac）2，Ca（Ac）2，Mg（NO3）2，Cu（NO3）2，Mn（Ac）2，Zn（Ac）2，Cr（NO3）3，Pb（NO3）2，Ni（NO3）2，Co（Ac）2，Cd（NO3）2均為分析純，購自Sigma公司。

Hemin溶液：稱取0.01304 g Hemin，溶于4 mL DMSO中，使用前根據需要稀釋。

2.2 Hg2＋的檢測

在10 mmol/L Tris-HAc（pH＝7.0），50 mmol/L KAc，0.002% （V/V） TritonX-100緩沖溶液中，加入終濃度分別為0.5 和2.0

SymbolmA@ mol/L 的鏈A和鏈B。為保證鏈A能夠充分地與鏈B結合形成分子間二倍體結構，將上述混合溶液在90 ℃條件下加熱5 min，緩慢降至室溫， 并在室溫下放置20 min；向其中加入不同濃度的Hg2＋，室溫下放置40 min；再加入終濃度為1

SymbolmA@ mol/L的Hemin，室溫下放置1 h；加入ABTS（終濃度為3.2 mmol/L）和H2O2（終濃度為2.0 mmol/L）至總體積100

SymbolmA@ L。5 min后，用UV-1901紫外分光光度計掃描反應產物ABTS#8226;＋的吸收光譜，利用418 nm處的吸光度值進行定量分析。

2.3 圓二色（CD）光譜檢測

按2.2節的方法配制DNA混合物，在高溫下加熱并降至室溫后，向其中加入4

SymbolmA@ mol/L Hg2＋，室溫下隔夜放置。用1 cm比色皿在235～320 nm范圍內測定圓二色光譜，平均掃描3次，掃描速度為100 nm/min，響應時間為1 s，帶寬為0.1 nm。

2.4 實際樣品中Hg2＋回收率的檢測

按2.2節的方法配制DNA混合物，將該混合物在高溫下加熱并降至室溫后，向其中加入50

SymbolmA@ L實際水樣（占總體積的1/2）和一定濃度的Hg2＋，室溫下放置40 min；再加入終濃度為1

SymbolmA@ mol/L的Hemin，室溫下放置反應1 h；最后加入ABTS（終濃度為3.2 mmol/L）和H2O2（終濃度為2.0 mmol/L）至總體積

Fig．1 Schematic representation of Hg2＋ detection method using split G-quadruplex DNAzyme為100

SymbolmA@ L。5 min后，用UV-1901紫外分光光度計掃描反應產物ABTS#8226;＋的吸收光譜，利用418 nm處的吸光度值并借助于建立的標準曲線計算回收率。

3 結果與討論

3.1 Hg2＋傳感器的工作原理

設計的Hg2＋傳感器使用了兩條寡核苷酸鏈（圖1，鏈A和鏈B）。其中鏈A由3部分組成，I和III兩部分分別位于鏈A的5′-端和3′-端，為可形成G-四鏈體的富G序列（圖1帶下劃線的序列）。對于I和III兩部分而言，由于分別含有3個和1個GGG重復序列，各自都不具備G-四鏈體的形成條件。但若兩部分能夠相互接近，則可締合形成G-四鏈體結構。鏈A的II部分為富含胸腺嘧啶堿基T的序列，它位于上述兩段富G序列中間。鏈B與鏈A 中I和II兩部分連接處的一段序列互補。在特定的條件下，鏈A與鏈B結合形成分子間二倍體結構。由于鏈A中I的部分序列被包埋在了該分子間二倍體結構當中，

使I和III兩部分無法相互接近形成G-四鏈體結構。而在Hg2＋存在下，鏈A中富T的II部分可自身彎折形成一個分子內的二倍體結構。該二倍體結構中的T-T錯配由于可以與Hg2＋作用形成T-Hg2＋-T堿基對而能夠穩定存在[23，24]。由于該分子內二倍體結構的形成部分地占據了鏈B在鏈A上的結合位點，從而降低了鏈B與鏈A結合的穩定性，使鏈B從鏈A上解締下來，釋放出富G序列。同時，上述分子內二倍體結構的形成又可以使位于其兩端的富G序列相互接近，兩者締合形成穩定的G-四鏈體結構。由于該G-四鏈體是由同一DNA鏈上的兩段富G序列締合而成，因此將其稱之為分子內裂分G-四鏈體。該裂分G-四鏈體可以與Hemin結合，形成具有過氧化物酶活性的G-四鏈體DNA酶，催化H2O2氧化ABTS的反應，生成的陽離子自由基ABTS#8226;＋在波長418 nm處有最大吸收，利用檢測體系在該波長處吸光度值的變化可以實現Hg2＋的檢測。

圖2 鏈A（1）、鏈A＋鏈B（2）及鏈A＋鏈B＋7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋（3）存在下檢測體系的吸光信號

Fig．2 Absorption signals of sensing systems containing Strand A （1）， Strand A＋Strand B （2）， Strand A＋Strand B＋7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋ （3）

為驗證上述Hg2＋傳感器的可行性，對3個不同的檢測體系所表現出的過氧化物酶活性進行了比較研究，結果如圖2所示。當只有鏈A存在時，檢測體系在λ＝418 nm處顯示了較強的吸收信號，說明這時檢測體系具有較強的過氧化物酶活性。這是因為在沒有鏈B存在時，鏈A中單鏈的II部分的柔韌性也可以導致兩端的富G序列相互接近形成G-四鏈體結構，并在Hemin的存在下顯示較強的酶活性。而當有鏈B存在時，檢測體系的酶活性顯著下降，證明鏈B的存在確實可以抑制G-四鏈體結構的形成。當向此檢測體系中加入Hg2＋后，檢測體系的酶活性又明顯增強，與預期的結果相符。證明Hg2＋的存在破壞了鏈A與鏈B的結合作用，促進了分子內裂分G-四鏈體結構的形成。

圖3 鏈A（1）、鏈A＋鏈B（2）及鏈A＋鏈B＋4.0

SymbolmA@ mol/L Hg2＋（3）存在下的CD光譜曲線

Fig．3 CD spectra of Strand A （1）， Strand A＋Strand B （2）， Strand A＋Strand B＋4.0

SymbolmA@ mol/L Hg2＋ （3）

3.2 CD光譜檢測

為了進一步驗證上述Hg2＋檢測機理的合理性，對不同檢測體系的CD光譜信號進行了考察。CD光譜是進行G-四鏈體結構研究的重要手段。以往的研究結果顯示，平行構型的G-四鏈體

的CD光譜在265 nm附近有一個正峰，在245 nm附近有一個負峰；反平行構型的G-四鏈體在295 nm附近有一個正峰，在265 nm附近有一個負峰[25]；對于典型的雙螺旋DNA，其CD光譜在245 nm附近有一個負峰，正峰的位置則會隨具體DNA序列的不同而不同，一般出現在260～280 nm之間[26]。從圖3可見，當只有鏈A存在時，檢測體系的CD光譜在265 nm處有一個正峰，在245 nm處有一個負峰，這是平行G-四鏈體的典型特征，證明鏈A自身可以折疊成平行的G-四鏈體。而當鏈B存在時，檢測體系的CD光譜在280 nm附近出現了一個肩峰，證明了鏈A/鏈B分子間二倍體的形成。當向檢測體系中加入Hg2＋時，280 nm處的肩峰消失，此時的CD光譜曲線的形狀與鏈A單獨存在時的情況相似，說明鏈A/鏈B的分子間二倍體結構被破壞，G-四鏈體結構重新形成。

3.3 鏈B的優化選擇

根據前面所描述的Hg2＋檢測原理，鏈B的長度要進行仔細的選擇。鏈B既不能太短，也不能太長。太短會導致鏈B與鏈A之間不能形成穩定的分子間二倍體，從而無法有效抑制鏈A自身折疊成G-四鏈體。鏈B太長，則會導致鏈B與鏈A之間形成的分子間二倍體太過穩定，即使加入Hg2＋也無法破壞兩條鏈的締合作用。本研究設計了5條不同長度的鏈B（B1～B5），并通過對比有無Hg2＋存在下檢測體系吸光信號的變化，對這5條鏈進行選擇（圖4）。對于無Hg2＋存在的情況下，當鏈B的堿基 圖4 鏈B的優化選擇。

白色：無Hg2＋；黑色：加入

7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋

Fig．4 Selection of strand B， white bars: without Hg2＋; black bars: 7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋;

B1： 5′-AAACAATCCC; B2: 5′-AAACAATCCCG; B3: 5′-AAACAATCCCGC; B4: 5′-AAACAATCCCGCC; B5: 5′-AAACAATCCCGCCC.數目由10個（B1）增加到12個（B3）時，檢測體系的吸光度值逐漸下降。隨著鏈B長度的繼續增加，檢測體系的吸光度值變化不大。此結果表明，12個堿基長度的鏈B3足以與鏈A形成穩定的分子間二倍體結構，有效抑制G-四鏈體結構的形成。而對于Hg2＋存在下的情況而言，檢測體系的吸光度值也隨著鏈B長度的增加而下降。這是因為鏈B越長，鏈A/鏈B分子間二倍體的解締也越困難，Hg2＋參與下形成的G-四鏈體越少。為此，選擇兩種條件下吸光度差值（ΔA）最大的鏈B3作為優選鏈。同時，為確保在沒有Hg2＋存在時鏈A能夠充分轉化為鏈A/鏈B分子間二倍體，鏈B的濃度設為鏈A的4倍。

3.4 Hg2＋傳感器的靈敏度和選擇性

為了驗證設計的傳感器用于Hg2＋定量檢測的可行性，考察了不同Hg2＋濃度下檢測體系在λ＝418 nm處的吸光度值變化。如圖5所示，在低Hg2＋濃度范圍內，檢測體系的吸光度隨Hg2＋濃度的增加而增大。在1.0～2.0

SymbolmA@ mol/L濃度范圍內，吸光度隨Hg2＋濃度的變化減緩。之后，隨著Hg2＋濃度的繼續增加，檢測體系的吸光度值迅速增大，并在Hg2＋濃度為7.5

SymbolmA@ mol/L 時達到最大。即在50～500 nmol/L及2.0～7.5

SymbolmA@ mol/L兩個濃度范圍內，檢測體系的吸光度值與Hg2＋濃度呈線性關系，線性相關系數R分別為0.9909和0.9931。出現兩個線性濃度范圍的原因可能是由于鏈A與Hg2＋之間的協同作用[27]。利用上述兩個線性范圍，可以分別對低濃度和較高濃度范圍內的Hg2＋進行定量檢測。按3倍信噪比（S/N）計算得出檢出限為47 nmol/L，與文獻報道的結果相當（表1）[4～8，20]。

考察了幾種常見金屬離子對Hg2＋檢測的干擾。從圖6可見，當以7.5

SymbolmA@ mol/L的上述金屬離子代替

圖6 Hg2＋傳感器的選擇性，白色柱狀條代表不加Hg2＋時體系的吸光度值，黑色柱狀條代表7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋存在時體系的吸收值，其中各種干擾離子濃度均為7.5

SymbolmA@ mol/L

Fig．6 Selectivity of the Hg2＋-sensing system. White bars represent the absorption signals of the sensing systems in the presence of 7.5

SymbolmA@ mol/L other metal ions. Black bars represent the absorption signals of the sensing systems in the presence of 7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋ and 7.5

SymbolmA@ mol/L other metal ions

圖5 檢測體系在λ＝418 nm處的吸光度值隨Hg2＋濃度的變化，插圖為在50～500 nmol/L的濃度范圍內，吸光度值隨Hg2＋濃度的變化

Fig．5 Hg2＋ concentration-dependent change in absorption signal at λ＝418 nm. The insert shows the absorption signal change in Hg2＋ concentration range of 50～500 nmol/L

Hg2＋加入到檢測體系中時，檢測體系均沒有表現出明顯的信號變化。而當將這些金屬離子與Hg2＋同時加入到檢測體系中時，檢測體系均獲得了明顯的信號增長，且信號變化的程度與單獨加入Hg2＋的情況相當。上述結果表明，此Hg2＋傳感器具有良好的選擇性，多種常見金屬離子的存在均不會對Hg2＋的檢測產生干擾。

值得注意的是，即使是對G-四鏈體具有超強穩定能力的Pb2＋也未對該Hg2＋傳感器產生干擾。推測原因：當使用裂分G-四鏈體DNA酶時，形成G-四鏈體的富G序列被分割成了兩段。在鏈A/鏈B分子間二倍體中，兩段富G序列處于相互遠離的狀態，各自都不具備形成G-四鏈體的條件。即使是Pb2＋對G-四鏈體結構的穩定能力再強，對這種情況也是無能為力的。 因為Pb2＋并不能使兩部分富G序列相互接近，這一點只有在Hg2＋存在下才能完成。若不使用裂分G-四鏈體，即只在Hg2＋探測序列的一端存在一段富G序列，且這段富G序列自身即可滿足G-四鏈體的形成條件。那么，在Pb2＋的存在下，這段富G序列具有強烈的形成G-四鏈體的趨勢。就某一條鏈B而言，它在無Pb2＋時可以抑制G-四鏈體的形成，而在Pb2＋存在下則無法完全抑制。這樣就會導致背景信號的提升，對檢測產生正干擾。總而言之，相比于非裂分的情況而言，裂分G-四鏈體DNA酶的使用增加了對兩段富G序列相互接近的需求，

3.5 回收率測定

采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，對純凈水、礦泉水及自來水樣品進行了加標回收實驗，結果如表2所示。各樣品的平均回收率為97.5%～104.5%，可以滿足實際水樣中痕量Hg2＋的分析要求。

4 結 論

利用G-四鏈體DNA酶進行了Hg2＋傳感器的設計。該傳感器設計方法簡便，不需要對使用的寡核苷酸鏈進行任何標記，也不需要依賴任何昂貴的儀器。通過采取分子內裂分G-四鏈體的設計模式，極大地提高了傳感器的抗干擾能力，一些常見的金屬離子的存在都不會對Hg2＋的檢測產生干擾。利用該Hg2＋傳感器，可在50～500 nmol/L及2.0～7.5

SymbolmA@ mol/L兩個濃度范圍內實現Hg2＋的定量檢測，檢出限為47 nmol/L。對實際水樣的加標回收結果顯示，設計的傳感器可以滿足實際水樣中痕量Hg2＋的分析要求。考慮到一些金屬離子或小分子物質的存在可以對G-四鏈體結構的形成及穩定性產生較大的影響[28]，本實驗的研究結果表明：使用裂分G-四鏈體進行某些傳感器的設計，可望在一定程度上提高傳感器的選擇性。

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Specific Hg2＋ Quantitation Using Intramolecular

Split G-Quadruplex DNAzyme

XU Jing， KONG De-Ming.

（State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology， Nankai University， Tianjin 300071， China）

Abstract G-quadruplex DNAzymes are peroxidase-like complexes formed by Hemin and some nucleic acid G-quadruplexes. Based on this kind of DNAzymes， several chemical sensors and biosensors have been developed. To improve the selectivity of G-quadruplex DNAzyme-based Hg2＋ sensors， intramolecular split G-quadruplex DNAzyme was introduced in the design of Hg2＋ sensor. For this new Hg2＋ sensor， G-quadruplex-forming G-rich sequence was divided into two parts that were linked to the two ends of a Hg2＋-sensing sequence. In the absence of Hg2＋， G-quadruplex structure could not be formed because G-rich sequence was partly caged into an intermolecular duplex. In the presence of Hg2＋， however， the stabilization of the T-T mismatch by Hg2＋ could promote the folding of the Hg2＋-sensing sequence into an intramolecular duplex， accompanied by the destruction of the intermolecular duplex and the formation of an intramolecular split G-quadruplex， which can form catalytically active G-quadruplex DNAzyme upon hemin binding. Utilizing the increase of peroxidase activity of the sensing system， a Hg2＋ detection method has been developed. Using this method， Hg2＋ quantitation can be achieved in the concentration ranges of 50－500 nmol/L and 2.0－7.5

SymbolmA@ mol/L， with a detection limit of 47 nmol/L. The use of split G-quadruplex DNAzyme can increase the dependence of the sensor on Hg2＋， thus， increase the selectivity of the sensor. The method was applied to the determination of Hg2＋ in different water samples with the average recovery of 97.５%－104.5%.

Keywords DNAzyme; Split G-quadruplex; Sensor; Mercury

（Received 27 July 2011; accepted 27 October 2011）