柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測法測定面粉中的過氧化苯甲酰

摘 要 利用過氧化苯甲酰能夠在氯化血紅素的催化下將底物對羥基苯乙酸氧化成具有熒光的二聚體的性質，建立了柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測法測定面粉中過氧化苯甲酰的方法。優化了色譜分離條件和柱后衍生條件，結果表明： 催化劑氯化血紅素的濃度為8

SymbolmA@ mol/L，底物對羥基苯乙酸的濃度為80

SymbolmA@ mol/L，衍生化試劑的pH 10.5，衍生溫度為35 ℃時衍生效率最高。在優化條件下，過氧化苯甲酰的線性范圍為0.5～100 mg/L；樣品的檢出限為1 mg/kg，樣品的加標回收率為98.5%～99.5%。本方法與現有的高效液相色譜法相比，檢測面粉中過氧化苯甲酰具有抗干擾能力強，靈敏度高。

關鍵詞 柱后衍生；高效液相色譜；熒光檢測法；過氧化苯甲酰

2011-07-28收稿；2011-09-30接受

本文系國家質量監督檢驗檢疫總局科研計劃項目（No. 2011IK217）資助

* E-mail: mam@nbciq.gov.cn

1 引 言

過氧化苯甲酰（Benzoyl peroxide，BPO）是一種重要的有機過氧化物。由于BPO對小麥面粉具有后熟、增白等作用，長時間被用作面粉改良劑。然而，過氧化苯甲酰不僅能破壞面粉中的維生素A、E等營養成分，而且還會產生對人體有害的苯甲酸和苯酚等有害物質。2011年2月11日，衛生部聯合六部委下發了《關于撤銷食品添加劑過氧化苯甲酰、過氧化鈣的公告（2011年 第4號）》，要求自2011年5月1日起，禁止在面粉中添加過氧化苯甲酰。

目前，過氧化苯甲酰的檢測方法主要有高效液相色譜法[1～3]、毛細管電泳法[4]、氣相色譜法[5]、間接碘量法[6]、紫外分光光度法[7，8]及靜態注射化學發光法[9]等。高效液相色譜-熒光檢測法測定某些有機過氧化物的方法已有報道，一般是采用辣根過氧化酶（HRP）[10，11]或氯化血紅素（Hemin）[12，13]作為催化劑，以對羥基苯乙酸為底物測定有機過氧化物。然而，目前報道的這此類方法僅限于測定過氧化氫、過氧酸類的有機過氧化物等水溶性有機過氧化物，對過氧化苯甲酰的研究未見報道。本研究以氯化血紅素為催化劑，對羥基苯乙酸為反應底物，采用柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測法檢測面粉中過氧化苯甲酰。由于該衍生反應具有一定的專屬性，因此本方法與現有的高效液相色譜法相比，檢測面粉中過氧化苯甲酰具有抗干擾能力強，前處理簡單，靈敏度高等優點。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Alliance e2695型高效液相色譜儀，配有2475型熒光檢測器（美國Waters公司）； PINNACLE PCX型柱后衍生器（美國PICKERING公司）；S40K型pH計（瑞士Mettler公司）；甲醇和乙醇（色譜純，迪馬科技公司）；氯化血紅素（分析純，Sigma公司）；對羥基苯乙酸（98%，Acros公司）；過氧化苯甲酰、85% H₃PO₄、氨水（25%）、NH₄Cl、冰乙酸（分析純，國藥集團）。

2.2 實驗方法

2.2.1 衍生試劑的配制 2.68 g NH₄Cl溶于200 mL水，加入30 mL 氨水，定容至500 mL；將2.6 mg氯化血紅素和6.6 mg對羥基苯乙酸溶于500 mL上述緩沖溶液中，即得柱后衍生試劑。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為SunFireTMC18柱（250 mm×4.6 mm×5

SymbolmA@ m），流動相為含有0.1%乙酸的甲醇-水（85∶15， V/V）體系，流動相在使用前用0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾，流速為0.6 mL/min，柱溫為20 ℃，樣品盤溫度為4 ℃。

2.2.3 衍生條件 衍生化試劑為含有8

SymbolmA@ mol/L氯化血紅素和80

SymbolmA@ mol/L對羥基苯乙酸的NH₄Cl-NH₃#8226;H2O緩沖溶液（pH 10.5）。流速為0.2 mL/min，反應管溫度為35 ℃；熒光檢測器激發波長315 nm，發射波長400 nm。

2.2.4 樣品處理 取1.0 g面粉于10 mL比色管中，加入2 mL乙腈，充分搖勻以沉淀面粉中的蛋白質，再用乙醇定容至10 mL， 充分振蕩混勻，用0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾后進樣。

3 結果與討論

3.1 衍生反應

本方法基于的柱后衍生反應如下式：

對羥基苯乙酸在Hemin的催化下被過氧化苯甲酰氧化成能夠產生熒光的二聚體2，2′-二羥基-聯苯-5，5′-二乙酸，而過氧化苯甲酰則被還原成苯甲酸。

3.2 色譜條件的優化

3.2.1 流動相的選擇 實驗表明，甲醇-水體系作為流動相，過氧化苯甲酰的響應峰峰形拖尾較為嚴重，加入少量乙酸后， 峰形可以獲得明顯改善。研究了添加乙酸對BPO響應峰的影響，結果表明，隨加入0.1% HAc（V/V）時，BPO響應峰峰形對稱，檢測速度較快。

考察了不同比例甲醇對過氧化苯甲酰響應峰的影響，結果表明，流動相為甲醇-水（85∶15， V/V）時，過氧化苯甲酰的峰形較好，出峰時間較短，分析速度較快。

3.2.2 柱溫的選擇 有機過氧化物穩定性一般較差，因此，在分析過程中可能存在分解的現象，因此，在高效液相色譜檢測有機過氧化物時往往采用較低的柱溫和樣品盤溫度[12]，但也有采用較高柱溫進行分離檢測的方法[1]。由于過氧化苯甲酰的半衰期溫度為72 ℃/10 h，在20 ℃下，可以忽略過氧化苯甲酰分解造成的影響。因此，柱溫選擇20 ℃。

3.3 柱后衍生條件的優化

3.3.1 氯化血紅素濃度的影響 研究了不同催化劑濃度下對BPO響應峰峰面積的影響，結果見圖1a。由該圖可知，在其它條件不變的情況下，過氧化苯甲酰的響應峰峰面積在氯化血紅素的濃度為8

SymbolmA@ mol/L時達到最大值，表明在此濃度下衍生效率最高。

3.3.2 反應底物的濃度的影響 研究了不同反應底物濃度下對BPO響應峰峰面積的影響，結果見圖1b。由該圖1b可知，當對羥基苯乙酸的濃度為1

SymbolmA@ mol/L時，無法獲得有效的BPO響應峰; 當對羥基苯乙酸濃度達到10

SymbolmA@ mol/L時，隨著對羥基苯乙酸濃度的增大，BPO響應峰的峰面積逐漸增大; 當達到80

SymbolmA@ mol/L時，BPO響應峰的峰面積是對羥基苯乙酸濃度為10

SymbolmA@ mol/L時的5～6倍。此后，BPO響應峰的峰面積趨于穩定。因此，對羥基苯乙酸濃度選擇為80

SymbolmA@ mol/L。

3.3.3 衍生溫度的選擇 研究了衍生溫度對BPO響應峰峰面積的影響，結果見圖1c。由圖1c可知，衍生溫度為35 ℃時，BPO峰面積最大。因此，選擇35 ℃作為最佳衍生溫度。

Fig．1 Effect of hemin concentration （a） ， p-hydroxyphenylacetic acid concentration （b） and temperature （c） on derivatization efficiency

3.3.4 pH值的影響 對羥基苯乙酸在Hemin的催化下，被過氧化苯甲酰氧化成具有熒光的二聚體2，2′-二羥基-聯苯-5，5′-二乙酸，2，2′-二羥基-聯苯-5，5′-二乙酸， 在堿性條件下的熒光強度比酸性條件下大得多。分別研究了pH 8～13范圍內的衍生條件，結果表明，用NH₄Cl-NH₃#8226;H2O為緩沖體系，pH為10～11時，衍生效率最佳，靈敏度最好，故選擇pH 10.5為優化條件。

3.4 標準曲線、線性范圍、相關系數、檢出限和重現性

在優化的色譜條件和柱后衍生條件下，選擇一系列過氧化苯甲酰標準溶液進行測試，結果表明，在0.5～100 mg/L濃度范圍內，BPO響應峰峰面積與其濃度成良好線性關系，線性回歸系數R.2＝0.9997，線性方程為A＝

Symbolm@@ 1.05×10.7＋3.34×10.7c， 其中A為峰面積，c為BPO濃度（mg/L）。

本方法對過氧化苯甲酰的檢出限為0.1 mg/L（信噪比為3），換算成樣品的檢出限為1 mg/kg。方法的檢出限明顯低于目前大多數面粉中過氧化苯甲酰的方法的檢出限[1～5，7，8]，說明本方法靈敏度較高。

連續進樣6次，計算BPO響應峰峰面積的RSD為2.7%，BPO響應峰保留時間的RSD為0.7%，說明方法的重現性良好。

3.5 樣品分析及回收率

隨機選擇兩種市售面粉為分析對象，按照2.2.4節進行樣品處理，在優化的色譜條件和衍生條件下進行分析，其標準品的色譜圖和樣品的色譜圖為圖2。樣品檢測和標準加入實驗結果見表1。由表1可

知，被分析的市售面粉中含有一定量的BPO，樣品的加標回收率在98.5%～99.5%之間，結果令人滿意。 圖2 過氧化苯甲酰標準色譜圖（A）和樣品色譜圖（B，C）

Fig．2 Chromatograms of benzoyl peroxide （BPO） standards solution （A） and samples（B， C）本方法利用氯化血紅素作為催化劑，由于有機過氧化物在Hemin的催化下能夠使底物對羥基苯乙酸迅速生成具有較強熒光的二聚體的，實現了面粉中BPO的柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測。本方法靈敏度高，線性范圍寬，回收率好，具有較好的實用性。

（mg/kg）加標測定結果Found（mg/kg）回收率Recoveries（%）

143.72063.699.5231.62051.398.5

References

1 LU Qi-Lin. Chinese Journal of Chromatography，2002， 20（5）: 464～466

魯奇林. 色譜， 2002， 20（5）: 464～466

2 WANG Qin， ZHANG Cun-Ling， XU Wen-Jie. Physical Testing and Chemical Analysis， Part B， 2002， 38（7）： 361～362

王 勤， 張存玲， 徐文杰. 理化檢驗-化學分冊， 2002， 38（7）： 361～362

3 LEI Gen-Hu， XIONG Xiao-Hu， HUO Yan-Min. Journal of Northwest University（Natural Scince Edition）， 2006， 36（6）： 911～914

雷根虎， 熊曉虎， 霍艷敏. 西北大學學報（自然科學版）， 2006， 36（6）： 911～914

4 WANG Quan， YANG Geng-Liang， ZHANG Li. Chinese Journal of Chromatography， 2007， 25（3）: 341～343

王 全， 楊更亮， 張 驪. 色譜， 2007， 25（3）: 341～343

5 ZHOU Min， KE Chun-Hui， GUO Bai-Kun. Chinese Journal of Health Laboratory Technology， 2008， 18（12）： 2563～2564

周 敏， 柯春暉， 郭柏坤. 中國衛生檢驗雜志， 2008， 18（12）: 2563～2564

6 JIA Shu-Zhen， LI Fa-Sheng. Practical Handbook for Food Additives. Zhengzhou：Henan Science Technology Press， 1996: 147～150

賈淑貞， 李發生.實用食品添加劑手冊. 鄭州： 河南科學技術出版社， 1996： 147～150

7 WANG Xiao-Peng， LIU Xin. Journal of Taishan Medical College， 2010， 31（6）： 446～447

王曉鵬， 劉 欣. 泰山醫學院學報， 2010， 31（6）： 446～447

8 WU Ying-Chun， NIE Feng. Journal of Shanxi University of Technology（Natural Science Edition）， 2010， 26（2）： 55～57

吳迎春， 聶 峰. 陜西理工學院學報（自然科學版）， 2010， 26（2）： 55～57

9 MENG Lei， LIU Yan-Chao， YU Zai-Qian， WANG Zhi-Rong， TIAN Shi-Xian， ZHOU Shao-Wen， YUAN Chao． Acta Agricultural Jiangxi， 2008， 20（12）： 85～86

孟 磊， 劉炎超， 于在乾， 王志榮， 田世賢， 周邵文， 袁 超. 江西農業學報， 2008， 20（12）： 85～86

10 Guilbault G G， Brignac P J， Juneau M． Anal. Chem.， 1968， 40（8）： 1256～1263

11 Hellpointner E， Gaeb S， Nature， 1989， 337（6208）： 631～634

12 XU Jin-Rong， CHEN Zhong-Ming. Chinese Journal of Chromatography， 2005， 23（4）： 366～369

徐金榮， 陳忠明. 色譜， 2005， 23（4）： 366～369

13 QI Bin， TANG Xiao-Yan， ZHANG Yuan-Hang， SHAO Ke-Sheng， HU Min， CHEN Zhong-Ming. Chinese J. Anal. Chem.， 1998， 26（9）： 1041～1046

齊 斌， 唐孝炎， 張遠航， 邵可聲， 胡 敏， 陳忠明. 分析化學， 1998， 26（9）： 1041～1046

Determination of Benzoyl Peroxide in Wheat Flour by Post-column

Derivatization-High PerformanceLiquid Chromatography

with Fluorescence Detection

MA Ming1， XIAO Ling-Yan.2， SHENG Ya-Hong.1， HUANG Jiao.1， YU Xiong-Fei.1

.1（Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Technical Center of China， Ningbo 315012， China）

.2（Societe Generale de Surveillance S.A.-China Standard Technology Development Corp.

Standards Technical Services Co.， Ltd. Ningbo Branch， Ningbo 315040， China）

Abstract A method for the determination of benzoyl peroxide in wheat flour by post-column derivatization-high performance liquid chromatography with fluorescence detection was developed based on the reaction that the p-hydroxyphenylacetic acid can be oxidized to the fluorescent dimer by benzoyl peroxide with hemin as catalyzer. The optimum derivatization efficiency was obtained with the hemin and p-hydroxyphenylacetic acid concentration at 8

SymbolmA@ mol/L and 80

SymbolmA@ mol/L， respectively， with the derivatization reagent pH at 10.5 and the derivatization temperature at 35 ℃. The linear range between 0.5 mg/L to 100 mg/L was observed for the established method. The sample detection limit was 1 mg/kg and standard spike recoveries were 98.5%－99.5% under the optimized conditions. The obvious advantages of excellent anti-jamming capability and high-sensitivity were observed comparing with other HPLC methods for determination of benzoyl peroxide.

Keywords Post-column derivatization; High performance chromatography; Fluorescence detection; Benzoyl peroxide

（Received 28 July 2011; accepted 30 September 2011）