柱前衍生-反相高效液相色譜法測定2-去氧葡萄糖的含量

摘 要 [HS]采用對氨基苯甲酸乙酯為衍生化試劑，建立柱前衍生化反相高效液相色譜法（RPHPLC）測定2去氧葡萄糖的含量。結(jié)果表明，最適的衍生化條件為反應(yīng)溫度85 ℃，反應(yīng)時間1.5 h，衍生化試劑（ABEE）和單糖（2DG/Glu）的摩爾比為25∶1；色譜條件為色譜柱Hypersil ODS2 （250 mm × 4.6 mm，5

SymbolmA@ m），流動相為0.02%TFA乙腈（80∶20，V/V） ，流速1.0 mL/min，波長307 nm。本方法在1～700 mg/L 濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r＝0.9999）；定量限（S/N＝10）及檢出限（S/N＝3）分別為450和100

SymbolmA@ g/L；平均加標回收率為101.7%；RSD為0.7%；日內(nèi)及日間精密度均小于0.7%。表明本方法靈敏度高，測定結(jié)果準確，重復(fù)性好，可用于2去氧葡萄糖樣品的準確定量分析。

[KH*3/4D][H]關(guān)鍵詞 [HS]2去氧葡萄糖； 柱前衍生； 反相高效液相色譜法； 對氨基苯甲酸乙酯

[HT][HK]

[FQ（3２，X，DY－Ｗ][CD15] 20110701收稿；20111123接受

本文系海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費基金 （No.201005020），福建省科技重大專項經(jīng)費基金 （No.2010NZ00012）和廈門市海洋與漁業(yè)局科技計劃項目經(jīng)費基金 （廈海漁合\\[2010\\]9號） 資助項目

* Email: bhhong2004@sina.com [HT]

1 引 言

2去氧葡萄糖（2Deoxyglucose，2DG）是多種天然抗生素及抗腫瘤藥物的藥效成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老、止血及鎮(zhèn)痛等\\[1，2\\]多種生理藥理效應(yīng)，在醫(yī)藥、食品、化妝品及科學研究領(lǐng)域\\[3，4\\]具有廣闊的應(yīng)用前景。建立2DG的快速定量方法，對糖生物學與糖醫(yī)學等科學研究及應(yīng)用具有重要意義。

2DG的檢測方法有離子色譜法和柱前衍生高效液相色譜法\\[5，6\\]。前者方便、準確，但通用性不佳；后者不僅測定結(jié)果準確，還可以克服其缺點。文獻\\[6\\]曾采用對氨基苯甲酸乙酯（pAminobenzoic ethyl ester，ABEE）衍生化法分離分析2去氧葡萄糖，但所采用的色譜柱是耐堿性的C18柱，流動相為pH 9.0的硼酸鉀緩沖液，這對常用的C18柱（pH＝2.0～8.0）幾乎不適用。本研究采用0.02%三氟乙酸（pH 2.65）乙腈為流動相，適用于幾乎所有C18柱，并以等度洗脫代替梯度洗脫，縮短分析時間；文獻\\[7～9\\]報道過的ABEE衍生化法所用的糖濃度都較高（25.6 mmol/L），未見采用低濃度糖溶液衍生化的方法。本研究建立的低濃度（2 mmol/L）糖溶液衍生化的方法，為低濃度糖溶液的衍生化提供了參考。本研究采用柱前衍生反相高效液相色譜法同時分離分析2去氧葡萄糖和葡萄糖，方法具有通用性廣、分析時間短、靈敏度高、測定結(jié)果準確、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Alliance 2695高效液相色譜儀（配2996二極管陣列檢測器）， 3100單級四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀; MicroMass LCT PremierTM XE高分辨質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Bruker VERTEX70 紅外光譜儀; Bruker400 核磁共振儀（德國Bruker公司）。

2DG（自制）；葡萄糖（中國藥品生物制品檢定所）；鼠李糖（99%），阿拉伯糖（98%），對氨基苯甲酸乙酯（99%），氰基硼氫化鈉（95%）均購自Aladdin公司；三氟乙酸、甲醇、乙腈（色譜純，Tedia 公司）；冰醋酸（分析純，西隴化工股份有限公司）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm，自制）。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Hypersil ODS2 （250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m）；柱溫：25 ℃；進樣體積：10

SymbolmA@ L；流動相： 0.02%TFA乙腈（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：307 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；電離電壓（毛細管電壓）3.5 kV；一級錐孔電壓35 V；二級錐孔電壓3.0 V；六級桿透鏡電壓0.1 V；源溫度（Source temperature）120 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氮氣流速500 L/h；錐孔氮氣流速50 L/h；高、低質(zhì)量數(shù)分辨率均為15；質(zhì)譜掃描范圍m/z 100～400。

2.3 樣品處理

準確稱取2DG樣品25 mg，用超純水溶解定容25 mL， 搖勻后取出1.0 mL定容，依次加入1.0 mL 0.15 mol/L ABEE甲醇溶液、1.0 mL 0.08 mol/L NaBH3CN甲醇溶液和50

SymbolmA@ L冰醋酸，于85 ℃水浴中反應(yīng)1.5 h，取出放冷至室溫，用超純水定容至25 mL，溶液經(jīng)0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾后直接進樣，進樣量10

SymbolmA@ L。3 結(jié)果與討論

3.1 2DG的結(jié)構(gòu)確證

自制的2DG經(jīng)紫外掃描發(fā)現(xiàn)， 在195 nm處有很弱的紫外吸收；紅外光譜（KBr壓片法）：3412，3353，3258 （υOH），2925（υＣH），1461，1411，1366（δＣH），1119，1082，1009（υCO）；核磁共振（400 MHz，DMSO）氫譜：6.51 （1H，d，CHO），4.78 （2H，m，OH），4.61 （1H，m，OH），4.46 （1H，m，OH），3.66～3.42 （2H，m，CH2（OH）），3.33 （1H， m， CH），3.01 （1H，m，CH（OH）），2.91 （1H，m，CH（OH）），1.89～1.25 （2H，m，CH2）；碳譜：13C1（93.38），13C2（76.78），13C3（71.60），13C4（70.79），13C5（61.26），13C6（41.25）；高分辨質(zhì)譜顯示的準分子離子峰m/z 187.0582 \\[M＋Na\\]＋ 與2DG結(jié)構(gòu)分子量相符。以上數(shù)據(jù)可以確證2DG的結(jié)構(gòu)。

3.2 衍生化條件的優(yōu)化

衍生化時間、溫度及衍生化試劑與單糖的摩爾比均會影響衍生化反應(yīng)產(chǎn)率（圖1）。本實驗確定衍生化反應(yīng)的最佳條件為反應(yīng)時間： 1.5 h； 反應(yīng)溫度：85 ℃；ABEE與2DG/Glu的摩爾比為25∶1。衍生化反應(yīng)式見圖2。

圖1 反應(yīng)時間（a）、反應(yīng)溫度（b）和衍生化試劑（ABEE）與2DG/Glu的摩爾比例（c）對衍生化反應(yīng)產(chǎn)率的影響?yīng)?/p>

Fig．1 Effects of reaction time（a）， reaction temperature（b）and molar ratio of paminobenzoic ethylester （ABEE） to 2deoxyglucose/glucose （2DG/Glu）（c）on derivative reactions

（●）2DG； （▲）Glu．[HT][）]

 分 析 化 學第40卷

第5期尤小云等： 柱前衍生反相高效液相色譜法測定2去氧葡萄糖的含量  

圖2 2DG和ABEE衍生化的反應(yīng)式

Fig．2 Reaction course of 2DG with paminobenzoic ethyl ester[HT][）]

3.3 LCMS結(jié)果

按2.3節(jié)處理樣品，將2DG和Glu混合，進行柱前衍生化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在2.2節(jié)的色譜及質(zhì)譜條件下進行LCMS分析，得到的色譜與質(zhì)譜圖如圖3所示。其中，圖3B中a及b分別為圖3A峰1及峰2的全掃描質(zhì)譜圖。圖3Ba的基峰質(zhì)荷比為330，與Glu衍生化產(chǎn)物的加氫分子離子峰（\\[Glu＋ABEE＋H\\]＋）的質(zhì)荷比一致；圖3Bb的基峰質(zhì)荷比為314，與2DG衍生化產(chǎn)物的加氫分子離子峰（\\[2DG＋ABEE＋H\\]＋）的質(zhì)荷比一致。此結(jié)果表明：2DG及Glu與衍生化試劑ABEE的反應(yīng)是按照（圖2）所推斷的1:1進行的，2DG和Glu的衍生化產(chǎn)物與H＋結(jié)合，產(chǎn)生穩(wěn)定的準分子離子峰m/z 314和330。LCMS總離子流圖（圖3A）同時顯示，衍生化試劑在單糖衍生產(chǎn)物之后出峰，無需萃取除去，不會干擾2DG及Glu的測定，簡化了衍生化步驟。

圖3 2DG及Glu衍生物的LC/MS色譜圖（A）及質(zhì)譜圖Ba和Bb

Fig．3 Chromatograms of LC/MS （A） and mass spectra （Ba and Bb）of 2DG and Glu derivatives

1. Glu（m/z 330）；2. 2DG（m/z 314）； Ba. 峰1的質(zhì)譜圖（Mass spectra of peak 1）； Bb. 峰2的質(zhì)譜圖（Mass spectra of peak 2）。[HT][）]

圖4 4種單糖衍生物的色譜圖

Fig．4 Chromatograms of four derivatized monosaccharides

1. Glu衍生物（Glucose derivative）； 2. 阿拉伯糖衍生物（Arabinose derivative）； 3. 鼠李糖衍生物（Rhamnose derivative）； 4. 2DG衍生物（2DG derivative）； 5. 對氨基苯甲酸乙酯（pAminobenzoic ethyl ester）。[HT][）]

3.4 方法專屬性

考察常見單糖對2DG測定結(jié)果的影響。將鼠李糖、葡萄糖及阿拉伯糖與2DG混合，按最適的衍生條件與ABEE衍生后，在2.2節(jié)的色譜條件下進行HPLC分析。2DG的回收率為103.1%；RSD為0.9%。4種單糖衍生物的色譜圖如圖4所示，表明在其它單糖存在的情況下，不會影響2DG的定性及定量分析。



3.5 線性關(guān)系、檢出限及定量限

按2.3節(jié)配制濃度分別為1， 10， 20， 40， 100， 200， 300， 400， 500， 600和700 mg/L的樣品溶液，進樣量均為10

SymbolmA@ L，峰面積（y）對進樣濃度（x）的線性回歸方程為y＝54533x＋26685，相關(guān)系數(shù)r＝0.9999，線性范圍為1～700 mg/L。逐級稀釋樣品溶液，當信噪比（S/N）為3時，確定其檢出限為100

SymbolmA@ g/L；信噪比（S/N）為10時，確定其定量限為450

SymbolmA@ g/L。

3.6 日內(nèi)及日間精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

按2.3節(jié)配制的低、中、高濃度的樣品溶液，測定其日內(nèi)及日間精密度，結(jié)果見表1。3種濃度的日內(nèi)

[ＦＱ（８２。２０，Ｙ－ＷＺ][H”][HJ*4]表1 2DG衍生物的日內(nèi)及日間精密度

Table 1 Interday and intraday precision of 2DGderivative

[HT6][BG（][BHDFG4，WK１２，ＷＫ１４Ｗ]2DG衍生物的濃度

Concentration of 2DG

derivative（mg/L）RSD（%）日內(nèi)Interday日間Intraday

320.70.6400.10.4480.10.5[BHDFG1*2，WKZQ0W] [BG）W][HT][HJ]

和日間RSD均小于0.7%，日內(nèi)和日間精密度良好。

配制3個不同濃度的2DG溶液，按2.3節(jié)進行衍生化反應(yīng)（n＝3），測得平均含量為102.0%，RSD為0.4%，表明方法的重復(fù)性良好。樣品溶液于25 ℃放置，分別在0， 1， 2， 4， 6， 8， 10， 12和24 h進樣，考察衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性，9個時間段峰面積的RSD為0.3%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 實際樣品的檢測結(jié)果

對2DG樣品進行3種不同濃度水平的加標回收實驗（n＝3），結(jié)果見表2。平均回收率為101.7%；RSD為0.7%，說明本方法的檢測結(jié)果準確度良好。實際樣品的檢測結(jié)果見表3。

[KH*4D][H”][HJ*4]表2 2DG樣品的加標回收率

Table 2 Average recovery of 2DG sample

[HT6][BG（][BHDFG４，WK７\\.4W]加入量Added（mg）

測得量Obtained

（mg， n＝3）

回收率

Recovery

（%， n＝3）RSD（%）10.1610.34101.8

12.7013.00102.4 0.74

15.2415.34100.9 [BG）Ｆ][HT][HJ]

[][H”][HJ*4]表3 樣品分析及結(jié)果

Table 3 Analytical results of samples

[HT6][BG（][BHDFG４，WK8，WK20W]組分

Component

（%）

樣品 SamplesS1S2S3S42DG97.3598.6497.1097.9997.23Glu1.291.362.422.012.56[BG）Ｆ][HT][HJ]

結(jié)果表明， 本方法可同時測定2去氧葡萄糖和葡萄糖含量，敏度高、線性范圍寬以及穩(wěn)定性好。



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Detection of 2Deoxyglucose by Precolumn Derivation Reversed

Phase High Performance Liquid Chromatography



YOU XiaoYun1，2， HONG BiHong*2，4， XIE QuanLing2， YI RuiZao1，2， XU RuiAn1，3

1（Institute of Molecular Medicine， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China）

2（The Third Institute of Oceanography State Oceanic Administration， Xiamen 361005， China）

3（Xiamen Key Lab of Marine Gene Engineering Drugs Engineering Research Center of Molecular Medicine，

Ministry of Education， Xiamen 361021， China）

4（Department of Materials Science and Technology， College of Chemistry and Chemical Engineering，

Xiamen University， Xiamen 361005， China）



Abstract A method was developed for the determination of 2deoxyglucose（2DG）by reversed phase high performance liquid chromatography （RPHPLC） after precolumn derivated with paminobenzoic ethyl ester （ABEE）. The results showed that the optimum derivation conditions were as follows: reaction temperature was 85 ℃， reaction time was 1.5 h and molar ratio of derivative reagent （ABEE） to monosaccharide （2DG/Glu） was 25∶1. The derivative was analyzed on a Hypersil ODS 2 （250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m） column with a mixture of acetonitrile to 0.02% trifluoroacetic acid （TFA） （2∶80， V/V） as the mobile phase， at the flow rate of 1.0 mL/min and the detection wavelength at 307 nm. This method has a good linearity at the concentration from 1 mg/L to 700 mg/L （r＝0.9999）.The limit of detection was 100

SymbolmA@ g/L while the quantitative limit was 450

SymbolmA@ g/L. The average recovery of 2DG was 101.7% and the relative standard deviation （RSD） was 0.7%. The interday and intraday precision were both less than 0.7%，This method is of high sensitivity ， precision and repetition， indicating that it is suitable for precise quantitative determination of 2DG.

Keywords 2Deoxyglucose; Precolumn derivatization; Reversed phase high performance liquid chromatography; pAminobenzoic ethyl ester

（Received 1 July 2011; accepted 23 November 2011）

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《光譜分析儀器使用與維護》（化學分析工程師實用技術(shù)叢書，ISBN 9787122093233）

該書全面、系統(tǒng)地介紹了目前市面上流行的各類光譜分析儀器的使用與維護，每類儀器主要從儀器定性定量原理、儀器結(jié)構(gòu)與組成、儀器安裝與調(diào)試、儀器操作與使用、儀器維護與保養(yǎng)、儀器維修與故障排除等方面進行闡述，重點在于介紹儀器一線操作技術(shù)人員多年來的有關(guān)儀器操作和維護保養(yǎng)、故障排除等方面的經(jīng)驗，同時，對于儀器操作過程中一些注意事項也做了介紹。該書適合于我國專業(yè)檢測機構(gòu)和企業(yè)檢測等分析行業(yè)實驗室從事化驗、檢驗工作的中、高級操作人員等檢測一線專業(yè)技術(shù)人員閱讀，也可作為高等院校分析化學專業(yè)和專業(yè)培訓(xùn)機構(gòu)作為教材使用。

該書由化學工業(yè)出版社出版，劉崇華 主編，定價 49.0元。