分散固相萃取凈化與液相色譜/串聯質譜法測定牛奶中8類禁用藥物殘留

摘 要 建立了牛奶中8類禁用藥物的液相色譜串聯質譜（LCMS/MS）檢測方法。分析物包括5種硝基咪唑、7種β受體激動劑、9種雄性激素、7種糖皮質激素、3種雌性激素、2種鎮靜劑、1種氯霉素以及6種二羥基苯甲酸內酯共40種禁用藥物。樣品以β葡萄糖苷醛酶/芳基硫酸酯酶在乙酸銨緩沖液中酶解，用氨化和酸化乙腈各提取一次。提取液經改良的分散固相萃取（QuEChERS）凈化，濃縮后采用C18色譜柱分離（150 mm×2.1 mm i.d.，3.0

SymbolmA@ m）。以甲醇和水（含0.1%甲酸）、乙腈和水分別作為正、負電噴霧離子化模式的色譜分離流動相進行梯度洗脫，多反應監測模式進行定性和定量分析。7種藥物以內標法定量；33種藥物以基質標準曲線外標法定量， 氯霉素在0.02～0.4

SymbolmA@ g/kg；39種藥物在0.20～10.0

SymbolmA@ g/kg范圍內相關系數（r）均大于0.99；定量限（S/N＝10）在0.07～0.93

SymbolmA@ g/kg之間。分別以各個藥物0.5， 1和2倍MRPL（Minimum required performance limits）濃度水平加標驗證實驗，回收率范圍60.3%～119.3%范圍；相對標準偏差小于18.9%。

[KH*3/4D][HTH]關鍵詞 [HTSS]硝基咪唑； β受體激動劑； 雄性激素； 糖皮質激素； 雌性激素；鎮靜劑； 氯霉素； 二羥基苯甲酸內酯； 牛奶； 液相色譜串聯質譜； 分散固相萃取

[HT][HK]

[FQ（3２，X，DY－Ｗ][CD15] 20110926收稿；20111115接受

本文系國家自然科學基金（No.21107074）、中國博士后基金（No.20100480361）和深圳出入境檢驗檢疫局博士后基金（No.2010101）資助項目

 Email: yuezhenfeng@163.com[HT]

1 引 言

β受體激動劑、合成激素和二羥基苯甲酸內酯類藥物具有增加飼料轉化率、增加蛋白沉淀的作用，曾廣泛用于動物的促生長和育肥\\[1，2\\]。氯霉素\\[3\\]、硝基咪唑\\[4\\]屬于抗菌和抗原蟲類藥物，常用于禽畜類疾病和感染的預防和治療。鎮靜劑能抑制腦干及大腦皮質活動，可使動物嗜睡以減少運輸或屠宰中的損耗\\[5\\]。已有研究表明， 上述幾類藥物在動物肌肉、內臟及相關產品中的殘留可能對消費者造成中毒、抗藥性、致癌、致畸和致突變性等損害\\[6～8\\]。我國農業部235號公告明確規定，在動物性食品中不得檢出氯丙嗪、地美硝唑、甲硝唑、丙酸睪酮等治療藥物，禁止將氯霉素、克倫特羅、洛硝達唑、己烯雌酚、玉米赤霉醇等藥物用于食源性動物 \\[9\\]。許多國家和地區已將這些藥物列為禁用藥物\\[10～12\\]。然而受到利益驅使，近年來濫用違禁藥物造成動物源食品中藥物殘留超標的食品安全事件頻見報道。

建立動物源食品中多類禁用藥物的篩查和測定方法有利于提高效率、減少處理步驟和降低成本 \\[13\\]。然而，禁用藥物的殘留濃度低、不同類型藥物的理化性質差異大、基質復雜干擾大，故樣品前處理是多殘留分析的難點之一。本課題組參考以分散固相萃取用于飼料中多種激素分析的研究\\[14\\]，采用改良的QuEChERS方法結合LCMS/MS分析，建立了牛奶中8類禁用藥物多殘留的篩查和定量方法。相比現有方法具有更高的效率、更簡便的前處理過程，且各項性能滿足殘留分析要求。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

API5000 型四級桿串聯質譜儀配電噴霧離子源（美國AB公司）；1200型高效液相色譜儀和Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.0

SymbolmA@ m，美國Agilent公司）；漩渦振蕩混合器（美國Thermo公司）；Sigma低溫離心機（美國Sigma公司）；旋轉蒸發濃縮儀（德國Heidolph公司）；Gilson移液器（法國Gilson公司）。

40種標準物質和7種同位素內標物質（純度≥99%）購自美國Sigma Aldrich公司、德國Dr. Ehrenstorfer公司和WITEGA公司。β葡糖苷醛甙酶芳基硫酸酯酶（德國Helix Pomatia公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲酸（HPLC純，德國Merck公司）；乙酸銨（HPLC純，美國Fisher公司）；N丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、佛羅里硅土、石墨化碳黑（GCB）（天津博納艾杰爾公司）。

2.2 標準溶液和緩沖溶液的制備

稱取各標準物質10 mg（精確到0.1 mg），以甲醇（或乙腈）配制成濃度100.0 mg/L的單標儲備溶液。按藥物分類稀釋為10.0 mg/L混合標準溶液。所有溶液于

Symbolm@@ 30 ℃避光儲存。使用前移取適量混合標準溶液，以初始流動相或空白樣品提取液逐級稀釋成工作液，現用現配。另稱取7.7 g乙酸銨溶于480 mL水中，冰乙酸調節溶液pH值至5.2，以水定容到500 mL，得到乙酸銨緩沖溶液。

 分 析 化 學第40卷

第5期張 毅等： 分散固相萃取凈化與液相色譜/串聯質譜法測定牛奶中8類禁用藥物殘留 

2.3 色譜/質譜條件

正離子模式下以0.1%甲酸水溶液為流動相A，0.1%甲酸甲醇溶液為流動相B。梯度洗脫程序：0.0 min （10%B） →4.0 min （35%B） →5.0 min （50%B） →8.0 min （95%B） →10.0 min （95%B） →13.0 min （10%B）→22.0 min （10%B）。負離子模式下以水為流動相A，乙腈為流動相B。梯度洗脫程序：0.0 min （20%B） →7.0 min （98%B） →10.0 min （20%B）→16.0 min （20%B）。柱溫：30℃；進樣體積：10

SymbolmA@ L；流速：250

SymbolmA@ L/min。

電噴霧電離正離子模式（ESI＋）：噴霧電壓4500 V，霧化氣壓力345 kPa，去溶劑氣壓力448.5 kPa，氣簾氣壓力138 kPa，碰撞氣壓力41.4 kPa，離子源溫度450 ℃。負離子模式（ESI－）：噴霧電壓4500 V，霧化氣壓力345 kPa，去溶劑氣壓力345 kPa，氣簾氣壓力172.5 kPa，碰撞氣壓力69 kPa，離子源溫度500 ℃。

2.4 樣品預處理

2.4.1 樣品提取 深圳當地市售全脂牛奶，稱取2 g樣品（精確到0.01 g）于具塞離心管中，加入內標工作液和8 mL乙酸銨緩沖液，均質后加入30

SymbolmA@ L酶解液，37 ℃溫育12 h。加入15 mL 1%氨水乙腈溶液和5.0 g 無水Na2SO4，渦旋混勻1 min后，在4 ℃、9500 r/min下離心5 min，收集上清液。剩余部分加入15 mL 1%乙酸乙腈溶液，提取15 min后經離心，取上層清液與前次提取液合并，待凈化。

2.4.2 樣品凈化 將混合吸附劑一次性加入裝有提取液的離心管，渦旋分散。在4 ℃，以9500 r/min離心5 min后， 將有機相移至圓底燒瓶，42 ℃減壓蒸發至近干。10%甲醇水溶液溶解濃縮物并定容至2.0 mL，過0.22

SymbolmA@ m濾膜，供測定。

3 結果與討論

3.1 酶解影響 

動物體內的部分β受體激動劑、激素藥物殘留是以結合態存在，提取前需經水解或酶解使結合態藥物游離出來。實驗考察了酶解與未酶解樣品中各種藥物的回收率，發現酶解樣品中沙丁胺醇、克倫特羅和非諾特羅的回收率提高23%～45%\\[1\\]，其它藥物回收率變化小于20%。盡管酶解未顯著影響大部分藥物的回收率，但酶解后的基質更復雜，需要采用更有效的樣品提取和凈化方法。

3.2 質譜分析條件優化

采用微量擠壓泵連續進樣的方式，以各個藥物的標準溶液（2.0 mg/L）進行一級質譜全掃描（Full scan），確定其準分子離子。氯霉素、3種雌激素、6種二羥基苯甲酸內酯類藥物及2種內標物在ESI－模式下獲得準分子離子峰，其它30種化合物和5種內標物均在ESI＋模式下獲得準分子離子峰。參考歐盟2002/657/EC指令\\[11\\]，以準分子離子為母離子進行二級質譜掃描，選擇豐度較高的兩個碎片離子作為定量和定性離子，分別優化各個離子對的去簇電壓（Declustering potential， DP）、碰撞能（Collision energy， CE）以及碰撞室出口電壓（Collision cell exit potential， CXP）。綜合所有離子對獲得最強響應信號時質譜條件，優化了質譜離子源溫度、氣簾氣壓力、霧化氣壓力和輔助氣壓力。

3.3 色譜分離條件優化

以甲醇水、乙腈水及其分別添加2.0 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）為流動相，C18為色譜柱，考察40種藥物在不同流速和流動相條件下的分析結果。結果表明，采用200和300

SymbolmA@ L/min流速不及以250

SymbolmA@ L/min流速的靈敏度高。ESI＋模式以甲醇和水為流動相的靈敏度高于乙腈和水，加入甲酸可顯著提高分析物的響應信號。ESI－模式以乙腈水的靈敏度明顯高于甲醇水，其原因是乙腈更有利于分析物的去質子化。由于多殘留分析需要同時檢測幾十對甚至上百對離子對，駐留時間過短將影響方法性能。本實驗采用Analyst 1.5.1工作站鎖定各個化合物的保留時間，并在保留時間前后80 s采集該離子對信號，以確保待測物色譜峰的重現性和靈敏度。40種禁用藥物和7種內標物的定性/定量離子對、保留時間和質譜參數見表1（詳表見: http://www.analchem.cn/table/111093.pdf）。

內標物質 Isotope internal standard（7種，7 Compounds）

D6萊克多巴胺D6ractopamine308.2/290.28.751318

[BHDFG3，WKZQ0W] *: 定量離子對（Quantitative transition）。[BG）W][HT][]

3.4 樣品前處理條件的優化

3.4.1 提取溶劑的選擇 40種藥物包括含有氨基或亞氨基的β受體激動劑、鎮靜劑、糖皮質激素、雄性激素和雌性激素，中性至酸性的硝基咪唑類和二羥基苯甲酸內酯類藥物。實驗比較了乙睛、乙酸乙睛（1∶99， V/V）和氨水乙腈（1∶99， V/V）、甲苯乙腈（1∶3， V/V）、乙酸乙酯、丙酮乙酸乙酯（1∶2， V/V）、甲醇和甲醇乙腈（1∶1， V/V）提取40種藥物的回收率，如圖1所示。其中甲醇及其混合溶劑的共萃取物較多，且難以與水相分層；乙酸乙酯及其混合溶劑提取硝基咪唑類、糖皮質激素類和雌性激素類藥物的回收率低20%。甲苯乙腈可較好地提取大部分目標藥物。但甲苯具有毒性，不作為首選使用。乙腈能有效沉淀蛋白質，但對克倫特羅、沙丁胺醇、醋酸可的松和丙酸倍氯米松等pKa＞9的藥物以及甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑等弱酸性藥物的提取率較低。實驗發現， 以氨化乙腈和酸化乙腈分兩次提取樣品，偏堿性或偏酸性藥物回收率均有改善，總體回收率為42%～135%。其原因可能是乙腈中添加酸或堿能有效抑制藥物的離子化，從而增加分析物在有機相中的分配比例。

[TS（][HT5”SS]圖1 提取溶劑對牛奶樣品中8種代表性藥物回收率的影響

Fig．1 Influence of selected solvents on the recoveries of 8 representative compounds in bovine milk

1. 甲硝唑（Metronidazole）；2. 克倫特羅（Clentuterol）；3. 睪酮（Testosterone）；4. 倍他米松（Betanethasone）；5. 己二烯雌酚（Dienestrol）；6. 氯丙嗪（Chlorpromazine）； 7. 氯霉素（Chloramphenicol）；8. 玉米赤霉酮（Zearalanone）；A. 乙腈（Acetonetrile）；B. 乙酸乙腈 （Acetic acidacetonetrile， 1∶99， V/V）；C. 氨水乙腈（Ammoniaacetonetrile， 1∶99， V/V）；D. 甲苯乙腈（Tolueneacetonetrile， 1∶3， V/V）；E. 乙酸乙酯（Ethyl acetate）；F. 丙酮乙酸乙酯（Ethyl acetateacetone， 1∶2， V/V）；G. 甲醇（Methanol）；H. 甲醇乙腈（Methanolacetonetrile， 1∶1， V/V）。

3.4.2 QuEChERS吸附劑的選擇和優化 現有商品化QuEChERS吸附劑不適用于理化性質差異大的多種藥物殘留的樣品前處理。實驗分別以一定量的弗羅里硅土、GCB、PSA、C18與200～500 mg無水MgSO4混合，凈化加標水平為2.0

SymbolmA@ g/kg（氯霉素為0.2

SymbolmA@ g/kg）的牛奶樣品，考察各個藥物的回收率。結果表明，弗羅里硅土作為強極性吸附劑，無法去除提取液中的脂類、糖類雜質，僅10余種藥物回收率在50%～120%范圍。GCB通常用于去除植物提取液中的色素成分，因其可吸附較強的帶苯環官能團的藥物\\[16\\]，大部分β受體激動劑、二羥基苯甲酸內酯類藥物和雌激素的回收率小于50%。PSA能有效去除基質中的脂肪酸和甾醇類基質，但凈化后的提取液有油脂殘留，且包括硝基咪唑類、糖皮質激素類等10種藥物的回收率小于50%。考慮到PSA作為堿性吸附填料對酸性藥物有吸附作用，提取時需添加一定的酸以減少損失\\[17\\]。C18可有效去除脂類、糖類等親脂型雜質。但過量的C18也吸附氟甲睪酮、氫化可的松、丙酸睪酮等親脂性較強藥物。多殘留檢測方法需要在檢測靈敏度、最佳凈化效果和合理回收率之間尋求平衡點。使用以上4種吸附劑與無水MgSO4的組合無法使全部藥物獲得滿意的回收率。因此，實驗繼續考察其中PSA， C18和無水MgSO4混合的凈化效果。結果表明，每克樣品以50 mg PSA， 20 mg C18和300 mg無水MgSO4的混合吸附劑凈化，可獲得凈化效果和回收率之間較好的平衡。經優化的QuEchERS凈化的提取液呈無色、透明澄清，40種藥物的總體回收率為48%～122%。圖2為空白牛奶加標的定量離子色譜圖（部分藥物）。

[TS（][HT5”SS] 圖2 空白牛奶基質匹配標準溶液的定量離子色譜圖（氯霉素為0.10

SymbolmA@ g/kg，其它藥物為1.0

SymbolmA@ g/kg）

Fig．2 Chromatograms of quantification transitions of blank bovine milk matrixmatched standard （0.10

SymbolmA@ g/kg for chloramphenicol， 1.0

SymbolmA@ g/kg for other drugs）[HT][TS）]

3.5 分析方法的評價

3.5.1 方法的線性范圍、 檢出限和定量限 對克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、洛硝達唑、氯霉素、己二烯雌酚、氯丙嗪以內標法定量，其余33種藥物以基質曲線外標法定量。用空白樣品提取液配制濃度為0.1～10.0

SymbolmA@ g/kg（氯霉素為0.01～1.0

SymbolmA@ g/kg）的混合標準溶液，以濃度為橫坐標（x，

SymbolmA@ g/kg）和定量離子對峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸計算，所得相關系數均大于0.99。根據3倍和10倍信噪比確定化合物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。樣品中40種藥物的LODs為0.02～0.28

SymbolmA@ g/kg； LOQs為0.07～0.93

SymbolmA@ g/kg。表2列出部分藥物的線性范圍、回歸方程、相關系數、LODs和LOQs（詳表見: http://www.analchem.cn/table/11093.pdf）。

3.5.2 方法的回收率與精密度 參考各個藥物的MRPL值，無MRPL值的參考其同類藥物的MRPL值，以0.5， 1， 2倍MRPL濃度水平考察方法的添加回收率和精密度。總體回收率為60.3%～119.3%; RSD為3.0%～18.9%（表3）， 結果令人滿意。

[KH*4D][HT5”SS][*4]表3 牛奶基質中40種藥物的回收率和精密度（0.5， 1和2倍MRPL加標濃度水平，n ＝6）（簡表）

Table 3 The recoveries and accuracies of 40 drugs in spiked bovine milk. （at half minimum required performance limits （MRPL）， the MRPL and double MRPL， n ＝6） （Brief table）

[HT6SS][BG（][BHDFG3，WK24，WK11\\.3W]化合物種類

Species加標濃度Spiked （

SymbolmA@ g/kg）回收率Recovery （%）相對標準偏差RSD （%）

硝基咪唑 Nitroimidazoles1.0， 2.0， 4.060.3～119.34.0～17.0

β受體激動劑 βAgonists0.5， 1.0， 2.063.3～107.84.8～14.9雄性激素 Androgens0.5， 1.0， 2.0

62.5～108.93.4～13.2糖皮質激素 Glucocorticoids1.0， 2.0， 4.060.5～108.23.6～18.9雌性激素 Esterogens1.0， 2.0， 4.063.4～106.55.9～16.1鎮靜劑 Sedatives0.5， 1.0， 2.070.5～109.65.6～15.1氯霉素 Chloramphenicol0.05， 0.01， 0.0272.2～97.64.4～10.7二羥基苯甲酸內酯 Rasorcylic acid lactones （RALs）

1.0， 2.0， 4.060.4～108.93.0～12.8[BHDFG1*2，WKZQ0W][BG）W][HT][]

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

Determination of 8 Species of Banned Drugs in Bovine Milk by

Using QuEChERS Cleanup Approach and Liquid

ChromatographyTandem Mass Spectrometry



ZHANG Yi1， YUE ZhenFeng*１， LAN Fang1， ZHAO FengJuan1，

XIAO ChenGui1， OUYANG Shan1， WU WeiDong1， WU YongNing2， LI LiSU1

1（Food Inspection Center， Shenzhen EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Shenzhen 518045， China）

2（Institute for Nutrition and Food Safety， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102206， China）



Abstract A method was developed for determination of 8 species of unauthorized drugs in bovine milk by liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS）. All target drugs covered 5 nitroimidazoles， 7 βagonists， 9 androgens， 7 glucocorticoids， 3 estrogens， 2 sedatives， 1 chloramphenicol and 6 resorcylic acid lactones. After homogenization， the sample was mixed with βglucuronidase/arylsulfatase for enzymatic reaction in ammonia acetate buffer and followed by extraction with basic and then acidic acetonitrile solutions. Cleanup of the extracts was processed by a modified dispersive solid phase extration（QuEChERS）. The analystes were then separated by a C18column （150 mm×2.1 mm i.d.， 3.0

SymbolmA@ m） utilising gradient elution with methanol/water （containing 0.1% formic acid） and acetontrile/water， and finally detected by tandem mass spectrometry in positive/negative ESI mode. Identification and quantification were achieved by LCMS/MS with multireaction monitoring. Isotope internal standards for 7 compounds and matrixmatched calibrations were respectively used to quantify the residue contents. Good linearity in response was obtained in the concentration range of 0.02－0.40

SymbolmA@ g/kg for chloramphenicol and 0.20－10.0

SymbolmA@ g/kg for the other 39 analytes， with correlation coefficients larger than 0.99. The limits of quantification （S/N＝10） was around 0.07－0.93

SymbolmA@ g/kg. Method validation was carried out at half minimum required performance limits （MRPL）， MRPL and double MRPL level of each substance， and the recoveries were in the range of 60.3%－119.3% with relative standard deviations （RSD） smaller than 18.9%. 

Keywords Nitroimidazoles; βAgonists; Androgens; Glucocorticoids， Estrogens; Sedatives; Chloramphenicol; Resorcylic acid lactones; Bovine milk; Liquid chromatographytandem mass spectrometry; Dispersive solid phase extraction

（Received 26 September 2011; accepted 15 November 2011）

第40卷2012年5月 分析化學 （FENXI HUAXUE） 研究報告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第5期730～734

[BW（B（S*3/4，0，）][CD44][BW）]

DOI： 10.3724/SP.J.1096.2012.10638