以局部結(jié)構(gòu)類似物為類模板的分子印跡整體柱在線檢測三甲氧芐啶

摘 要 以三聚氰胺（MAM）為類模板分子，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）為交聯(lián)劑，聚乙二醇（PEG400）為致孔劑，原位聚合法制備了對三甲氧芐啶（TMP）有較強(qiáng)選擇性吸附作用的分子印跡（MIP）整體柱。以該MIP整體柱為高效液相色譜柱，考察了其在不同色譜流動(dòng)相組成條件下對TMP的識(shí)別性能。結(jié)果顯示，MIP整體柱在甲醇、乙腈、水等條件下能夠吸附TMP而不出峰。可以利用MIP整體柱在甲醇水（80∶20，V/V）中在線選擇性吸附（或富集）TMP，然后將流動(dòng)相轉(zhuǎn)換為甲醇進(jìn)一步除去疏水性雜質(zhì)，最后用強(qiáng)洗脫劑洗脫TMP出峰。MIP整體柱線檢測人血清中TMP的工作曲線為A＝42.8c

1 引 言

在分子印跡聚合物（MIP）的研究中，可以利用目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)（或局部結(jié)構(gòu)）類似物分子為類模板制備MIP，以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子或某一類目標(biāo)分子的選擇性識(shí)別\\[1～8\\]。這樣不僅可以有效避免MIP中殘余模板分子的泄漏對測定準(zhǔn)確性的影響?yīng)‐\[1\\]，還可解決某些成本昂貴、或在聚合溶液體系中難溶解目標(biāo)分子的MIP的制備問題\\[9\\]。MIP整體柱融合了MIP的選擇性和整體柱的高流通性、高柱效、制備簡單等特性，而且印跡柱內(nèi)的印跡位點(diǎn)完整，對目標(biāo)分子顯示出良好的選擇性識(shí)別能力\\[10\\]，已成為分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。MIP整體柱也已被用于多種藥物、或中藥有效成分的選擇性分離與分析\\[11～16\\]。

三甲氧芐啶（Trimethoprim，TMP），是一種廣譜抗菌藥，常與多種抗菌素合用，起到協(xié)同增效作用。已有研究表明，TMP對許多新的感染性疾病有臨床療效。發(fā)展新的、高選擇性和高靈敏的分析方法，對于準(zhǔn)確測定復(fù)雜基質(zhì)中的TMP有重要意義。以TMP為模板，采用本體聚合、懸浮聚合等方法制備的MIP已被應(yīng)用于TMP的固相萃取和電化學(xué)測定研究中\\[17，18\\]。劉祥軍等\\[19\\]制備了以TMP為模板的MIP整體柱，并研究了該印跡柱對TMP的識(shí)別性能。為了避免MIP中模板分子泄漏影響TMP測定的準(zhǔn)確性，本研究采用三聚氰胺（MAM）為類模板，制備MIP整體柱，測定TMP。聚乙二醇（PEG400）作為致孔劑，在整體柱內(nèi)形成大的貫穿孔，使MIP整體柱具有良好的通透性；此外，其還通過形成氫鍵，促使三聚氰胺溶解，最終使形成的印跡位點(diǎn)靠近柱內(nèi)貫穿孔道表面，為TMP分子進(jìn)入印跡空穴提供便利。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），采用20

SymbolmA@ L定量環(huán)；JSM6330F掃描電子顯微鏡（日本電子公司）；超純水儀（廣州科橋?qū)嶒?yàn)技術(shù)設(shè)備有限公司），高速離心機(jī)（Thermo 220/240）。

三聚氰胺（MAM，含量≥99.9%，廣州齊云生物科技有限公司）；三甲氧芐啶（TMP）、磺胺甲GFDA1唑（SMZ）、甲氨蝶呤（MTX）對照品購自中國生物制品藥品檢驗(yàn)所；葉酸（FOL，含量≥97%，HPLC級，上海晶純試劑公司）；甲基丙烯酸（MAA）、偶氮二異丁腈（AIBN）、聚乙二醇（PEG400）均為分析純（天津市科密歐公司）；二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA，含量98%，ACROS公司）；甲醇和乙腈（色譜純，默克公司）；乙酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；氨水（分析純，含氨25%的水溶液，廣東光華化學(xué)廠有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，EDMA使用前經(jīng)中性氧化鋁層析柱過濾提純，AIBN經(jīng)乙醇重結(jié)晶提純。其它試劑均為分析純。空白人血清由廣東藥學(xué)院門診部提供。

2.2 MIP整體柱的制備

將模板分子三聚氰胺（0.125 mmol）、甲基丙烯酸（1.5 mmol）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（13.5 mmol）溶于由甲醇和PEG 400組成的混合溶劑中，加入引發(fā)劑偶氮異丁腈（42.1 mg），冰浴、通氮?dú)?0 min，灌入不銹鋼色譜柱管（100 mm×4.6 mm，i.d）內(nèi)，兩端密封，在50 ℃水浴中反應(yīng)40 h。更換柱頭后將其接入高效液相色譜（HPLC） 系統(tǒng)中，分別用甲醇乙酸混合液（4∶1，V/V）、甲醇、甲醇氨水混合液（9∶1，V/V）沖洗，除去模板分子、致孔劑及未反應(yīng)的單體。最后分別用水、甲醇沖洗至基線平穩(wěn)。空白整體柱（NIP）的制備除不加模板分子外，其它步驟均與印跡柱相同。

 分 析 化 學(xué)第40卷

第5期張紅武等： 以局部結(jié)構(gòu)類似物為類模板的分子印跡整體柱在線檢測三甲氧芐啶 

2.3 色譜性能研究

分別以印跡整體柱（MIP柱）和空白整體柱（NIP柱）為色譜柱，考察不同流動(dòng)相條件下整體柱的容量因子（k）或印跡因子（IF）值。k＝（tR

Symbolm@@ t0）/t0，IF＝kMIP/kNIP。其中，tR為保留時(shí)間； t0為死時(shí)間，此處為丙酮的保留時(shí)間。流速為0.5或1.0 mL/min，檢測波長λ＝247 nm。

2.4 人血清樣品測定

先用甲醇將2.25 g/L的TMP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋到不同濃度。分取不同濃度的TMP標(biāo)準(zhǔn)溶液400

SymbolmA@ L，分別加入400

SymbolmA@ L乙腈、400

SymbolmA@ L空白血清，得到濃度為8.32， 18.7， 28.1， 37.5， 56.2， 75.0， 84.4和93.7 mg/L的血清標(biāo)液。振蕩混勻，以10000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行測定。按同樣方法配制4.16， 35.6和48.8 mg/L人血清樣品。

3 結(jié)果與討論

3.1 MIP整體柱的制備

TMP分子中的二氨基嘧啶環(huán)結(jié)構(gòu)與MAM的分子結(jié)構(gòu)極為類似（圖1），可采用MAM為類模板，制備對TMP有識(shí)別能力的MIP整體柱。MAM呈堿性， MAA的[TS（][HT5”SS]圖1 本實(shí)驗(yàn)中有關(guān)化合物分子結(jié)構(gòu)

Fig．1 Molecular structures of the tested compounds[HT][TS）]COOH基團(tuán)作為氫鍵的供體和受體能同時(shí)與MAM母體環(huán)上的N原子和取代基仲胺（NH）形成雙氫鍵而構(gòu)成多個(gè)多元環(huán)狀結(jié)構(gòu)\\[1\\]。多元?dú)滏I作用力和印跡位點(diǎn)空間幾何形狀的協(xié)同作用，構(gòu)成了MIP整體柱對MAM模板分子極強(qiáng)的選擇性識(shí)別能力 \\[20\\]。

圖2為對MIP整體柱和NIP整體柱截面的掃描電鏡對比圖。從圖2可見，由于PEG400通過占位、相分離、洗脫在整體柱床中形成大量貫穿孔，因而整體柱截面呈現(xiàn)網(wǎng)狀多孔的骨架結(jié)構(gòu)，具有良好的通透性。本實(shí)驗(yàn)所制備的整體柱以甲醇為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min時(shí)壓力為1.1～1.2 MPa。

PEG400能通過醚鏈上的氧原子與MAM分子產(chǎn)生氫鍵作用而促使MAM很快溶解，兩者在溶液中有可能以復(fù)合物形式存在。這種極性較強(qiáng)的大分子復(fù)合物可使聚合過程中相分離較早發(fā)生，且程度增大，引起聚合物堆積粒子成長程度增大，造成MIP柱內(nèi)聚合物堆積粒子尺寸較大（圖2）。NIP柱的聚合液中不存在這種復(fù)合物，因此聚合過程中的相分離程度小于MIP柱，聚合完成后產(chǎn)生的堆積粒子尺寸明顯小于MIP柱。[TS（][HT5”SS]圖2 MIP和NIP柱截面掃描電鏡圖（放大2500倍） 

Fig．2 SEM images of MIP and NIP column （magnification of 2500 times）[HT][TS）]

PEG400分子鏈上的氧原子與MAM分子上的部分NH2基團(tuán)產(chǎn)生氫鍵作用，造成功能單體MAA只能與MAM分子中的其它基團(tuán)發(fā)生較強(qiáng)的分子間相互作用，實(shí)現(xiàn)有效的自組裝（圖3）。當(dāng)聚合反應(yīng)完成、洗除PEG400和MAM后，便形成了靠近貫穿孔道表面的印跡空穴。大的流通空間和靠近孔道表面的印跡位點(diǎn)為MIP柱識(shí)別體積較大的TMP分子提供了便利。

3.2 流動(dòng)相組成對識(shí)別性能的影響?yīng)?/p>

TMP在甲醇、乙腈、純水等流動(dòng)相中能完全被MIP整體柱保留（考察到t＝30 min），在乙腈、純水流動(dòng)相中也能被NIP柱保留，而在甲醇流動(dòng)相中則緩慢從NIP柱上洗脫。從表1可見，在不同比例的甲醇水流動(dòng)相中，TMP在MIP柱上被完全保留。含水量低于50%（V/V）時(shí)，TMP不在NIP柱上保留；當(dāng)含水量高于50%（V/V）時(shí)，疏水作用力的影響占主導(dǎo)，TMP則又完全保留在NIP柱上。在乙腈水（V/V）分別為80∶20， 60∶40， 40∶60時(shí)，MIP和NIP柱上均檢測到TMP的出峰，但tR明顯不同，色譜峰型均展寬嚴(yán)重。

在甲醇中分別添加0.2%， 1.0%和5.0%（V/V）的乙酸時(shí)，TMP的保留時(shí)間（流速0.5 mL/min）分別為26.6， 23.4和39.1 min。可能是由于生成的甲氧芐啶乙酸鹽在甲醇中溶解度有限，TMP峰型均嚴(yán)重展寬。乙酸添加量較大時(shí)，保留時(shí)間反而延長。在甲醇中固定添加2.5%（V/V）的水、并同時(shí)分別添加0.1%， 0.2%和1.0%（V/V）乙酸時(shí)，保留時(shí)間值為5.16， 4.58和2.14 min。加入的水增大了甲氧芐啶乙酸鹽的溶解性，使TMP出峰時(shí)間明顯縮短， 峰型變窄。當(dāng)甲醇中添加0.5%（V/V）氨水時(shí)，TMP的保留時(shí)間為3.76 min，接近丙酮的出峰時(shí)間（3.19 min）。

3.3 最佳色譜流動(dòng)相的選擇

為實(shí)現(xiàn)人血清中TMP的選擇性富集與測定，綜合考慮上述流動(dòng)相的實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，選擇甲醇水（80∶20，V/V）為進(jìn)樣流動(dòng)相。此時(shí)，TMP在MIP整體柱上被選擇性富集，而在NIP柱上不被保留。然后，流動(dòng)相轉(zhuǎn)換為甲醇，進(jìn)一步除去疏水性雜質(zhì)。最后，再用強(qiáng)洗脫劑將TMP洗脫出峰。氨水甲醇（2.5∶97.5，V/V）在λ ＝ 247 nm處的背景吸收與甲醇接近，故選其為洗脫劑。

3.4 MIP整體柱的交叉選擇性

選擇了與TMP同屬二氫葉酸還原酶抑制劑的葉酸（FOL）， 甲氨蝶呤（MTX）以及經(jīng)常與TMP共同

Symbolm@@ ：未出峰或未計(jì)算IF （No obvious chromatographic peak， or no calculation of IF）; #：未檢測 （Not detecting）; *：緩慢洗脫出峰 （Eluting slowly）; kMIP: MIP柱容量因子 （Capacity factor for MIP monolithic column）; kNIP: NIP柱容量因子 （Capacity factor for NMIP monolithic column）; IF （kMIP/kNIP）：印跡因子（Imprinting factor）; λ＝247 nm，v＝0.5 mL/min[BG）Ｗ][HT][]

使用的磺胺甲GFDA1唑（SMZ）為考察對象，檢驗(yàn)MIP整體柱的結(jié)合選擇性。在甲醇水（80∶20，V/V）流動(dòng)相中，這3種相關(guān)藥物均不被保留，它們的保留時(shí)間分別為2.28（FOL）， 2.67 min（MTX）和1.83 min（SMZ）。從圖4可見，MIP整體柱內(nèi)的印跡空穴對TMP的嘧啶環(huán)有很高的選擇性識(shí)別能力。FOL， MTX和SMZ混合物在MIP整體柱上不被保留，而TMP被保留在柱上，直到被洗脫出峰。

本實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)明顯的MAM泄漏現(xiàn)象，而且MAM在λ＝247 nm時(shí)的吸收強(qiáng)度很弱，對TMP的準(zhǔn)確測定不產(chǎn)生影響。

3.5 人血清中TMP的測定

從圖5可見，甲醇水（80∶20，V/V）和甲醇可有效除去樣品中絕大多數(shù)背景雜質(zhì)，而TMP則選擇性地被富集在MIP柱內(nèi)。NIP柱經(jīng)洗脫后，未見TMP洗脫峰，僅顯示很小的溶劑峰；而在MIP柱上則可見明顯的TMP洗脫峰；空白血清樣在MIP柱上也沒有TMP洗脫峰。

以TMP血清標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值（c）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的TMP色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸：A＝42.8c－3.03（r＝0.9994），線性范圍為8.32～93.8 mg/L，檢出限按3倍的信噪比計(jì)算為0.145 mg/L。對35.6和48.8 mg/L兩個(gè)血清樣平行測定3次，回收率分別為93.5%（RSD＝1.0%）和94.1%（RSD＝2.5%）。濃度為4.16 mg/L（低于線性范圍最低值8.32 mg/L）的血清樣品，在甲醇水流動(dòng)相條件下連續(xù)進(jìn)樣（20

SymbolmA@ L）3次，洗脫峰面積測定值A(chǔ)＝471.2，計(jì)算值為11.08 mg/L，平均每針為3.70 mg/L，回收率為88.9%。

本研究以三聚氰胺為類模板、甲基丙烯酸為功能單體、二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑、PEG400為致孔劑制備MIP整體柱。PEG400不僅起到了致孔劑的作用，還促使MAM溶解，使印跡位點(diǎn)靠近孔道表面，為 TMP的識(shí)別提供便利。利用該MIP整體可在線選擇性富集、檢測人血清中的TMP。

[TS（10][HT5”SS] 圖4 MIP柱的識(shí)別選擇性

Fig．4 Cross selectivity of MIP column

a. SMZ （25.0 mg/L） ＋FOL （22.6 mg/L）＋MTX （23.8 mg/L）＋TMP （22.5 mg/L）; b. SMZ （25.0 mg/L）＋FOL （22.6 mg/L）＋MTX （23.8 mg/L）。 流動(dòng)相（Mobile phase）: 0～15 min 甲醇水（Methanolwater， 80∶20，V/V），v ＝ 0.50 mL/min； 15～21 min甲醇（Methanol）， v＝1.0 mL/min； 21～31 min氨水甲醇（Ammonia watermethanol， 2.5∶97.5，V/V），v＝1.0 mL/min；λ＝247 nm。

[TS（10][HT5”SS] 圖5 MIP柱與NIP柱測定人血清樣中的TMP（加標(biāo)35.6 mg/L）

Fig．5 Chromatograms of TMP in human serum （35.6 mg/L） on MIP and NIP columns

a． NIP柱測定人血清中TMP （NIP column）；b. MIP柱測定空白血清（blank human serum on MIP column）；c. MIP柱測定人血清中TMP （MIP column）。流動(dòng)相（Mobile phase）： 0～8 min甲醇水（Methanolwater， 80∶20，V/V），v＝0.50 mL/min; 8～18 min甲醇（Methanol），v＝1.0 mL/min；18～25 min 氨水甲醇（Ammonia watermethanol， 2.5∶97.5，V/V），v＝1.0 mL/min；λ＝247 nm。[HT][TS）]

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

Online Determination of Trimethoprim in Human Serum by

Molecularly Imprinted Monolithic Column with

Melamine Employed as Analogue Template



ZHANG HongWu， GUO JianWen， LI Kang， WANG WeiSheng，

WU YuPing， LU QiWen， ZHAI HaiYun*



（School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China）





Abstract A molecularly imprinted monolithic column being capable of selectively adsorbing trimethoprim （TMP） was synthesized by in situ polymerization method. During the polymerization process， melamine was employed as analogue template， and methacrylic acid as functional monomer， ethylene glycol dimethacrylate as cross linker， polyethylene glycol 400 （PEG400） as porogenic agent， respectively. The change of recognition ability for MIP column towards TMP was validated under different kinds of mobile phase compositions in a high performance liquid chromatographic （HPLC） system. Experimental results showed that MIP column could completely retain TMP under mobile phases of methanol， acetonitrile or water. TMP was selectively adsorbed in MIP column under methanolwater （80∶20， V/V）， then the hydrophobic impurities were further erased by changing the mobile phase to methanol， and finaly， the TMP peak was obtained in the elution step of with ammonia watermethanol （2.5∶97.5， V/V）. Online determination of TMP in human serum was performed in HPLC system with the imprinted column employed as chromatography column. The linear regression equation obtained was determined as A＝42.8c

Symbolm@@ 3.03（r＝0.9994） with the linear range of 8.32－93.8 mg/L and a limit of detection of 0.145 mg/L.

Keywords Trimethoprim; Molecularly imprinted monolithic column; Analogue template; Melamine， High performance liquid chromatography; Online determination