代謝組學方法研究姜黃根莖及塊根次生代謝產物表達差異

摘 要 [HTSS]基于GCMS的代謝組學分析方法，建立了分析不同產地來源的姜科植物姜黃（Curcuma. Longa L）的根莖（中藥姜黃）和塊根（中藥郁金）的次生代謝產物的方法。對樣品的提取方法、氣相升溫條件和方法學進行了考察，確定采用石油醚索氏提取法對樣品進行提取。色譜圖中主要化合物的精密度為1.2%～5.7%；重現性為2.18%～6.27%； 回歸系數R2＝0.699～0.972。數據處理采用SIMCAP軟件進行主成分（PCA）分析，通過主成分得分圖（Score plot）可以明顯區分姜黃的根莖及塊根樣品，說明在根莖和塊根中次生代謝產物的表達存在差異；通過載荷圖（Loading）和t檢驗（ttest）發現了14種表達差異顯著的化合物。這些化合物可能是姜黃根莖與塊根具有不同藥性和臨床用途的物質基礎。

[KH*3/4D][HTH]關鍵詞 [HTSS]次生代謝物； 姜黃； 氣相色譜質譜； 主成分分析

[HT][HK]

[FQ（3２，X，DY－Ｗ][CD15] 20110907收稿；20111116接受

本文系科技部國際合作項目（No.2009DFA31660）和973項目（No.2006CB504701）資助

* Email:huangluqi@263.net[HT]

1 引 言

代謝組學是對某種生物或細胞的所有低分子量代謝產物進行定性和定量分析的一門學科。代謝組學主要采用現代分析技術（例如，液相色譜質譜聯用、氣相色譜質譜聯用、核磁共振等）對植物次生代謝產物及機體內源性小分子代謝物進行分析，并采用模式識別技術對分析結果進行區分與判別，從中發現生物標識物，應用于疾病診斷、毒理機制研究和功能基因組學研究等方面\\[1，2\\]。

本研究借鑒代謝代組學的研究思路，對姜科植物姜黃（Curcuma. Longa L）的根莖和塊根的次生代謝產物進行分析。2010版中國藥典記載，姜黃的根莖和塊根作為兩種不同的中藥（姜黃和郁金），具有相反的藥性和不同的臨床用途\\[3～5\\]。由于二者來源于同一植物，其化學成分類型基本一致\\[6～9\\]。一直以來很難從植物化學的角度說明二者藥效差異的物質基礎。本研究采用GCMS的代謝組學分析方法，對不同產地的姜黃的根莖和塊根進行分析。本研究采用主成分分析（PCA）方法對分析結果進行建模處理。結果表明，主成分得分圖（Score plot）可以成功區分根莖（中藥姜黃）和塊根（中藥郁金）兩組樣品，說明二者次生代謝產物的表達存在差異；通過分析主成分分析載荷圖（Loading plot），確定了14種表達存在顯著差異的代謝產物，這些化合物可能是姜黃根莖與塊根具有不同藥性和臨床用途的物質基礎。2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

GCMSQP2010 Plus氣相色譜質譜儀（日本島津公司），配有自動進樣器， GCMS solution 2.5工作站和NIST質譜數據庫，離子源（Ion source） 為EI（電子轟擊）源。色譜柱采用ZB5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25

SymbolmA@ m，德國MachereyNagel公司）， 臺式高速離心機（美國Labnet公司）、Sartorious BT 25S 型1/100000電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）、索氏提取器。軟件：GCMSsolution version 2.5（SHIMADZU Corporation）， SIMCAP＋12.0（Umetrics，Sweden）， Microsoft Excel2003（Microsoft Corporation），色譜指紋圖譜相似度評價系統（國家藥典委員會）。

石油醚（沸程60～90 ℃，分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

樣品收集：姜科植物姜黃樣品采自四川省，采樣點分別為崇州市三江鎮宋橋村、崇州市聽江鎮三橋村、雙流縣金橋鎮舟渡村。每個采樣點采集樣品6份，樣品經中國中醫科學院中藥研究所黃璐琦研究員鑒定為姜科植物姜黃。

2.2 樣品制備方法

取收集的樣品按中國藥典2010版進行處理：分別取藥用部位（根莖和塊根）洗凈、切厚片、曬干、編號，其根莖即中藥材姜黃，塊根即中藥材郁金。

取姜黃（郁金）飲片粉碎、過20目篩（0.9 mm粒徑）；準確稱取10 g粉末，置于索氏提取器中，加入50 mL石油醚；連續提取8 h， 至新提取的液滴基本無色；將提取液移入50 mL容量瓶，用石油醚定容。

2.3 色譜和質譜條件

固定相采用低極性毛細管柱，根據GC/MS圖譜中的峰的分離情況和主要色譜峰的響應值，確定色譜參數。

采用OPTIMA5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25

SymbolmA@ m）；進樣口溫度250 ℃；氣流模式：恒流流速1.0 mL/min，進樣量1

SymbolmA@ L，分流（Splite）比1∶10；離子源為EI， 離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍m/z 400～800，掃描速度5000 aum/s。溶劑延遲4.5 min。 柱溫采用程序升溫：80 ℃（5 min） 8 ℃/min280 ℃（2 min）。

 分 析 化 學第40卷

第5期吳宏偉等： 代謝組學方法研究姜黃根莖及塊根次生代謝產物表達差異 

2.4 色譜圖處理和統計分析

色譜圖中各化合物通過工作站GCMSsolution version 2.5自帶的NIST 2002質譜數據庫進行鑒定，原始圖譜經積分后（信噪比S/N＞3），結果保存為文本格式。將文本文件（調整格式后）導入色譜指紋圖譜相似度評價軟件，將峰的匹配結果保存為Excel文件。上述數據導入SIMCAP＋12.0進行分析。采用主成分分析（PCA），通過得分圖（Scores plot）直觀地表達組間的代謝差異；通過載荷圖（Loading plot）初步篩選差異變量；通過ttest 對上述差異變量進行統計檢驗，確定差異代謝產物。3 結果與討論

3.1 樣品前處理方法的選擇

以甲醇提取劑時，由于其極性較大，易造成大極性成分在柱內殘留，且姜黃次生代謝產物主要為萜類化合物，故本研究選擇石油醚為提取劑。采用索氏提取法，以保證樣品制備的重復性。提取時間分別考察考察了1， 2， 5， 8和12 h，根據色譜圖譜中峰的數量及響應值確定提取時間為8 h。

3.2 GCMS條件優選及樣品分析

為了獲得良好的色譜分離度，本研究對氣相色譜的升溫程序進行了優化，考察了3種不同的升溫程序，最終確定了最佳的色譜條件見2.3節。由于儀器在開機時需要自動調諧，以保證質譜參數與出廠時一致。因此，本研究未對質譜條件進行優化，而是維持其固有設置不變。本實驗分離鑒定姜黃的根莖和塊根中共43種萜類次生代謝物，主要次生代謝產物如圖1所示。

[TS（][HT5”SS]圖1 姜黃（A）、郁金（B）GCMS總離子流色譜圖和匹配色譜圖（C）

Fig．1 GCMS TIC chromatograms of Turmeric （A）， and Radix curcumae （Tuberous root） （B）， and all samples（C）

1.α蒎烯（αPinene）； 2.莪術烯醇（Curcumenol）； 3.β月桂烯（βMyrcene）； 4.β蒎烯（βpinene）； 5.莰烯（Camphene）； 6.龍腦（Borneol）； 7.桉葉油素（1，8Eucalyptol）； 8.姜黃烯（Curcumene）； 9.芳姜黃烯（ArCurcumene）； 10. β姜烯（βZingiberene）； 11.β倍半水芹烯（βSesquiphellandrene）； 12.芳姜黃酮（ArTurmerone）； 13.姜黃酮（Tumerone）。[HT][TS）]

3.3 方法學考察隨機選取9種共有峰的峰面積為指標，進行方法學考察（表1）。

取同一個樣品， 制備完后連續進樣6次，根據色譜峰面積計算相對標準偏差（RSD），考察精密度。結果表明，各色譜峰峰面積RSD在1.2%～5.7%范圍內。

取同一個樣品，粉碎過篩后平行制備6份并進行測定，根據各峰面積計算RSD，考察重復性。 結果表明，各色譜峰峰面積RSD在2.2%～6.3%范圍內。

取同一樣本15 g，加入20 mL石油醚，索氏提取8 h后，以石油醚定容至25 mL。制備完后，按2， 5， 10和20倍稀釋成5份樣品，根據主要色譜峰面積和相對濃度，考察線性關系，并計算回歸系數（R2）在0.699～0.972之間。由于樣品成分復雜，對離子化影響較大，所以個別化合物的回歸系數較低。但是， 在統計分析中，各化合物匹配對齊后是以其相對含量進行統計，因此在重復性、精密度復合要求的前提下，個別化合物的回歸系數較低對統計結果無影響。檢測結果表明，所測樣品中相應峰面積均在線性范圍內。

[LM][HT5”SS][*4]表1 方法學考察結果

Table 1 Results of methodological study

[HT6SS][BG（][BHDFG４，WK7，WK20，WK10\\.3W]峰號Peak No.化合物

Compound精密度Precision（RSD， %， n＝6）重復性

Reproducibility（RSD， %， n＝6）回歸系數Regression coefficientR2

1α蒎烯 αPinene2.15.70.7012莪術烯醇 Curcumenol3.45.80.9323β月桂烯βMyrcene5.65.７0.8227

桉葉油素1，8Eucalyptol3.26.20.8949芳姜黃烯ArCurcumene4.65.50.78810β姜烯βZingiberene3.14.00.972

11β倍半水芹烯 βSesquiphellandrene1.26.30.85312芳姜黃酮Arturmerone

4.33.40.69913姜黃酮 Tumerone1.32.20.901[BHDFG3，WKZQ0W] * 峰號同圖1（Peak numbers are the same as in Fig.1）。[BG）W][HT][]

3.4 統計分析結果

本研究采用主成分分析法對化學分析結果進行處理。主成分分析為無監督模式識別技術，不考慮樣品的分類信息，通過對高維數據進行降維后，對樣品進行判斷。

結果表明，主成分得分圖可以從整體上直觀的顯示樣品間的差異。如圖2A所示，除個別樣品外，姜黃和郁金的樣本分別聚為一類，完全分離；說明姜黃的根莖和塊根次生代謝產物的表達存在差異。

主成分分析載荷圖為進一步確定化合物的含量差異提供了幫助。如圖2B所示，載荷圖上每個點代表一個變量，離原點距離越遠，表明該成分含量變化對分類的貢獻越大。經t檢驗，從中確定了14種代謝產物，其含量表達在姜黃和郁金間差異顯著。質譜圖與NIST質譜數據庫匹配進行鑒定，結果見表2。

[TS（][HT5”SS]圖2 主成分分析得分圖（scores plot）（A）和主成分分析的載荷圖（B）

Fig．2 Score plot （A） and Loading Plot（B） of PCA

□郁金（Radix curcumae）； ○ 姜黃（Turmeric）。[HT][TS）]

[HT5”SS][*4]表2 姜黃、郁金中14種差異次生代謝產物及相對含量比較

Table 2 Fourteen secondary metabolites of significantly different content between Turmeric and Radix curcumae of Curcuma longa L.

[HT6SS][BG（][BHDFG4，WK7，WK10，WK20，WK20W]編號

No.保留時間RT （min）化合物的鑒定Identified compound相對含量a Relative content郁金

Radix curcumae姜黃

Turmeric

12.868α蒎烯 αPinene10.34±3.5623.29±10.11*23.817莪術烯醇 Curcumenol

8.78±4.1111.72±3.45*34.844β月桂烯 βMyrcene10.21±3.234.91±1.11*46.090

異龍腦 Isoborneol1.11±0.343.78±0.21*56.267

龍腦 Borneol5.12±1.561.23±0.12*67.010

反10生姜醇 10Gingerol8.11±2.672.12±0.45*7

8.576桉葉油素 1，8Eucalyptol0.62±0.088.73±1.78*

912.970芳姜黃烯 ArCurcumene3.22±1.455.52±0.45*913.134αHimachalene1.43±0.345.12±2.22*1013.517β姜烯 βZingiberene7.88±2.1610.82±4.67*1114.487倍半水芹烯 βSesquiphellandrene4.33±1.7811.18±2.45*1215.483

芳姜黃酮 Arturmerone18.45±8.9829.48±10.34*13

15.574姜黃酮 Tumerone20.45±7.8838.23±11.23*1415.765姜黃新酮 Curlone10.33±5.6717.86±6.78*

*: 經t檢驗（ttest）； P＜0.05; a: 峰面積與樣品質量比（The ratio of peak area to sample mass， mAUs×105 intensity/g mean±SD， n＝18）。

在14種代謝物中，除月桂烯（βMyrcene）、龍腦（Borneol）和生姜醇（10Gingerol）外，其余化合物在根莖中的含量均明顯高于塊根。姜黃植物中萜類化合物多具有抗炎、降脂、抗癌等方面的活性\\[10，11\\]。由于在根莖和塊根中的含量差異，導致其在體內的吸收、代謝及藥效的不同，最終導致其作為兩種中藥應用于臨床，并且對其藥性的認識也不同。



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Metabonomic Study on Secondary Metabolites of Rhizome and

Tuberous Root of Curcuma longa L

WU HongWei， LI HongMei， TANG LiYing， XU HaiYu，

LI ShaoJing， TANG ShiHuan， YANG HongJun， SHAO AiJuan， HUANG LuQi*

（Institute of Chinese Materia Medica， Chinese Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）



Abstract A metabonomic method of GCMS was developed to investigate the difference of secondary metabolites in the rhizome and tuberous root of Curcuma longa L. The extraction conditions， temperature program and methodology were optimized. Using the petroleum ether as the extraction solvent and Soxhlet extraction， the method displayed good precision（RSD: 1.2%－5.7%）， repeatability（RSD: 2.2%－6.3%） and linearity （R2: 0.699－0972）. The analysis data were performed by SIMCAP software. Scores plot of PCA could successfully divide the rhizome and tuberous root samples into two groups respectively， which illustrate the difference of secondary metabolites between the rhizome and tuberous root. With the loading plot and ttest， the significant difference in two groups of fourteen endogenous metabolites were found， which may be the effective substance for explaining the different usage of the rhizome and tuberous root of Curcuma longa L. in Chinese medicine.

Keywords Secondary metabolites; Curcuma. Longa L; Gas chromatographymass spectrometry；Principal component analysis

（Received 7 September 2011; accepted 16 November 2011）