新型基因表達調控元件——人工核糖開關的構建及篩選

楊會勇，刁勇，林俊生，許瑞安

1 華僑大學分子藥學物研究所，福建 泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，福建 泉州 362021

近年來基因治療在人體臨床試驗中取得重大成功，標志該技術的有效性和安全性已獲得重大突破[1]，但如何按照病情需要實時調節轉基因表達水平，仍然是困擾該領域研究人員的難題[2]。以腎性貧血的基因治療為例[3]，促紅細胞生成素(EPO) 表達水平的過高表達會引起紅細胞過度增生，從而引起心肌梗塞腦血栓等嚴重不良反應，其危害可能等同甚至大于 EPO基因治療本身帶來的益處。糖尿病的基因治療，則對胰島素表達的時間節點和水平均有很高要求[2]。本課題組曾采用轉錄調控元件調節以重組腺相關病毒為載體的基因藥物 (rAAV-Ins) 的表達[4]。小鼠口服rAAV-Ins后，胰島素表達可以在1年的時間內隨血糖水平而調整。但遺憾的是，胰島素表達的高低與血糖水平變化之間有數小時的時滯，無法真正應用于臨床。

長期以來，生物體內基因表達的調控一直被認為是蛋白的“專利”。蛋白類轉錄因子的表達調控系統在基因治療臨床前及部分臨床研究中取得了一定的成功[2,5]，但蛋白調控系統必須將編碼蛋白因子的基因與治療基因一起轉染細胞，外源蛋白的免疫原性成為臨床應用面臨的首要問題。另外系統元件體積大、調節響應時間長等也是限制其臨床應用的主要缺點。多種具有基因表達調控功能的RNA元件的發現再一次挑戰了傳統分子生物學中心法則中關于RNA功能的定義[6]，其中一類是首先在細菌mRNA的5￠端非編碼區 (5￠UTR) 中發現的核糖開關 (Riboswitch)。目前發現的天然核糖開關均僅由一段35~200 bp的核苷酸序列組成，其結構與蛋白比較如此簡單，以至于在發現之初被認為其行使基因調控的能力非常有限。但深入的研究表明，核糖開關在基因表達調控方面所具有的功能與蛋白相比毫不遜色[7]。核糖開關對基因表達的調控不需要蛋白因子參與，免疫原性小；元件大小在數百堿基之內，構成非常簡單；響應配體時間一般在數分鐘之內，反應迅速；核糖開關位于mRNA之上，發揮順式調節作用，可實現緊密調節[8]。與蛋白調控系統相比較所表現出的諸多優點，使得核糖開關自發現之日起就引起了廣泛關注，日益深入的研究結果顯示其可以在代謝物檢測、新藥研制、基因表達調控等多個方面發揮重要作用[9]。

1 重組核糖開關的構建

1.1 簡化核糖開關

天然核糖開關在結構上可分為適體域與表達平臺域兩部分，但部分核糖開關的適體域與表達平臺域在結構上合二為一，即簡化核糖開關。早在正式提出核糖開關概念的4年前，Werstuck等就成功組建了一種簡化核糖開關[10]。他們將配體為毒性小、可穿透細胞膜的染料H33258的2種適體 H10和 H19串聯插入 Lac Z基因的5￠UTR，得到可在哺乳細胞內發揮作用的核糖開關。當在細胞培養基中加入配體后，插入 H10和H19適體序列與配體結合，阻礙了mRNA翻譯啟動，Lac Z基因表達水平可降低90%。該研究不僅證明采用基因重組技術創建核糖開關的可行性，還首次證明主要存在于原核生物的核糖開關在真核細胞內也可以發揮作用。

之后不同研究小組陸續報道了數種簡化核糖開關的構建，但所有的簡化核糖開關均表現為抑制型基因調節作用。研究結果表明，簡化核糖開關插入 mRNA的位置，決定了其作用機制是阻斷核糖體43S亞單位與mRNA帽子結構的結合，還是干擾核糖體對mRNA掃描[11]，多個適體結構串聯應用有助于調節配體的量效動力學范圍[12]。

1.2 復雜核糖開關

與簡化核糖開關不同，一個復雜核糖開關中含有相對獨立的適體域和表達平臺域，兩區域則由接頭序列相連接。據研究，復雜核糖開關中適體區域相對保守，而基因表達平臺域則有很大變化，甚至同一個配體小分子有多個作用機制不同的核糖開關對應[13]。因此，構建這類核糖開關時，一般是首先獲得高度特異和高親和力結合配體小分子的適體區域，然后根據需要選擇合適的表達調控機理，最后通過連接元件組裝成完整的核糖開關。

根據作用機理，復雜核糖開關可分為轉錄終止、翻譯啟動和 mRNA剪切等類型。當適體域與特定配體結合后，核糖開關的構象隨之發生改變，從而影響 mRNA的轉錄、翻譯起始或前體剪接過程[14-16]。

1.2.1 轉錄終止型復雜核糖開關

轉錄終止子是一種末端含有 polyU尾巴的RNA莖環結構，其中 polyU尾巴對終止子的功能至關重要，但不影響其莖環折疊。當RNA聚合酶進行 mRNA的轉錄時，如遭遇轉錄終止子的莖環結構便從轉錄模板脫落，下游序列的轉錄隨之終止。轉錄終止是天然核糖開關的常用機制，數個轉錄終止型核糖開關串聯可實現基因表達的嚴密調節[17]。Fowler等[18]選用茶堿適體TCT8-4組成適體域，以來源于枯草桿菌的MetI基因轉錄終止子為表達平臺，從含有抗終止子序列的文庫中篩選產生接頭序列，嘗試構建一種轉錄終止型核糖開關。很遺憾的是，該核糖開關的最終作用機制并不是轉錄終止，因為將終止子的polyU尾序列突變甚至敲除終止子后，其基因調控作用仍然保留。

1.2.2 翻譯啟動型復雜核糖開關

核糖體結合位點 (RBS) 是位于mRNA上游的特異序列，核糖體通過識別并結合 RBS啟動翻譯過程。在原核生物中該序列稱為SD序列，在真核生物中則稱為Kozak序列。Desai等[19]將茶堿適體插入LacZ報告基因RBS上游，適體序列與表達平臺形成的莖環結構將RBS屏蔽在內，阻斷了翻譯啟動過程。當加入茶堿后，適體與茶堿結合形成新的構象，將表達平臺域中的 RBS暴露在外，有利于核糖體參與的翻譯啟動。與大部分天然核糖開關不同，該核糖開關表現為激活型基因調控作用，基因表達水平呈配體劑量依賴性增加，最大激活指數 (激活后與激活前基因表達水平的比值) 可達8倍。因適體域和表達平臺間接頭序列的長度和堿基類別對激活指數以及配體的量效動力學范圍均有顯著的影響，采用細胞內篩選法對接頭序列進一步優化，可提高激活指數至36倍[20]。繼續對RBS序列同步優化，又可以提高激活指數至96倍[21]。

1.2.3 mRNA剪切調控型復雜核糖開關

在真核生物細胞內，mRNA前體的可變剪切既可產生功能不同的蛋白，又可以作為基因表達的有效調控手段[22]。近年來相繼在真菌及植物細胞mRNA的5￠端和3￠端UTR以及編碼區內發現核糖開關的存在，表明 mRNA選擇剪切型核糖開關能夠在真核細胞內有效發揮基因表達調節的作用[23-26]。一般 mRNA前體的一個有效的剪切部位形成需要包含3個識別位點：5￠端識別位點、分支序列和3￠端識別位點。研究表明[27]：當剪切識別位點處于 mRNA前體的發夾結構的莖結構內時，即被屏蔽而無法被剪切復合體識別，對 mRNA前體內含子的剪切過程也不再啟動。mRNA剪切調控型復雜核糖開關利用了這個特點：通過結合配體小分子，使剪切識別位點所處的莖環結構環境發生改變，從而啟動或阻礙剪切過程。這也是目前所發現的真核生物中核糖開關唯一的調控機制。

mRNA前體的剪切過程分為2個階段。在第一階段，mRNA前體在5￠剪接位點被剪切，內含子在分支序列處形成套索結構，但仍然與第二外顯子連接在一起；在第二階段，第一外顯子最后一個核苷酸的3￠-羥基親核攻擊內含子-第二外顯子套索結構間3￠剪接位點的磷酸二酯鍵，從而使兩個外顯子相互連接，內含子以套索結構形式被釋放。Kim 等[28]將茶堿核糖開關插入到前體mRNA的3￠剪接位點，這種結構可以在剪切過程的第二個階段抑制前體 mRNA的剪接。考慮到在剪切過程的早期進行調控可能效率更高，Kim等[29]又嘗試將核糖開關插入到編碼區的內含子中，并將內含子的分支序列位于適體域的莖結構內，結果配體引起的核糖開關構象改變形成新的發夾結構將分支序列屏蔽，從而在第一階段抑制了 mRNA的剪接。適體形成的莖環結構中，莖結構的大小及分支序列在適體內的位置，對剪切調控效率有明顯的影響。更有意思的是，該核糖開關還可以控制前體 mRNA的選擇性剪接。第一內含子的分支序列被屏蔽，導致第二內含子的分支序列在第一和第二內含子2個5￠剪接位點間進行選擇。第二內含子的分支序列如選擇第一內含子的5￠剪接位點，則有利于形成不含第二外顯子的mRNA。如果將第一內含子的分支序列以及第二內含子的5￠剪接位點同時屏蔽，則有可能進一步提高不含第二外顯子的mRNA的形成比例。由于絕大多數人類基因都會采用選擇性剪接方式進行調節，所以選擇性剪接核糖開關可能對基因治療更為重要。

2 重組核糖開關的篩選

2.1 適體的體外篩選

核糖開關的設計，首先要確定欲采用的配體。理想的配體應該具有可以透過細胞膜、細胞毒性小、胞內背景水平低等條件。如要應用于基因治療，最好是選擇諸如病情相關的指標性因子等為配體。理論上運用配體指數富集系統進化技術 (Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX) 可篩選得到任何指定配體的適體[30-33]。SELEX體外篩選RNA適體的基本過程為：首先運用化學合成技術建立一個含有核苷酸隨機序列的單鏈DNA (ssDNA) 文庫，經過體外轉錄得到包含1015條左右不同序列的RNA文庫。采用物理方法 (如柱層析) 篩選與特定配體結合的RNA序列。結合反轉錄和PCR方法擴增所選擇的RNA序列得到新的dsDNA文庫。經過10~15輪的建庫、篩選與擴增，最后得到RNA序列即為候選適體。對其中的序列逐一進行親和力和特異性的鑒定，符合要求的即確定為適體序列。對于一個配體一般可篩選得到數種序列各異的適體。為了獲得適體核心區域序列和構象，我們開發了一種基于適體核心區域保護的聚合酶鏈式擴增反應 (ARP-PCR) 方法，以便對SELEX得到的候選適體進行精確篩選[32]。將與靶分子結合的候選適體分子采用Dnase Ⅰ酶進行酶切，處于單鏈狀態的未結合序列被降解，剩余的與靶分子結合的序列即為適體區域核心序列。之后對適體核心序列進行莖環結構分析，可實現對適體核心區域的精確定位及序列構象確認。在核糖開關構建過程中，ARP-PCR方法還可用于檢測核糖開關結合配體小分子前后構象變化，提高核糖開關體外篩選的效率。而目前核糖開關高級結構分析多是應用操作復雜的X-衍射方法[34]。

采用SELEX方法體外篩選的適體，并不一定能保證可作為核糖開關的有效部件，因體外篩選環境不能準確反映細胞內的折疊條件。另外其文庫序列一般在1015條以下，最優的適體序列或許未被包含在內；多輪篩選過程也比較耗時。

光學波段包括可見光(380nm-760 nm)和近紅外(760nm-1200nm)，仿石器材的光譜曲線應與真山石相近。

2.2 功能性核糖開關的細胞內選擇

盡管基于SELEX體外篩選的適體可以成功構建簡單的核糖開關，但其有效性在一定程度上具有偶然性。經SELEX體外篩選得到適體，僅極少部分可以構建成在體內發揮作用的功能性核糖開關[35-36]。Weigand等[37]將50 000種候選適體序列進行細胞內功能篩選，最終得到的最佳序列與SELEX體外篩選所得到的序列大相徑庭，說明對配體的親和力和專屬性僅僅是適體成為核糖開關的必要條件。

2.2.1 傳統遺傳篩選

遺傳篩選是檢測細胞中生物分子功能的最優方法，因細胞的存活與其表現型密切相關，篩選得到的細胞一定帶有所需的特質。為了保證構建的核糖開關在細胞內仍然具有調控功能，Desai等率先提出進行遺傳篩選的思路[19]。該方法的第一步是建立核糖開關文庫，然后轉染大腸桿菌進行遺傳特質篩選。所采用的適體是經體外篩選得到的茶堿適體，基因為氯霉素乙酰轉移酶。當核糖開關被茶堿激活后，氯霉素乙酰轉移酶得以大量表達，培養基內的氯霉素被降解，大腸桿菌可存活，而不含有活性核糖開關的大腸桿菌均不能生長。將篩選出來的活性核糖開關與突變體以1∶1 000 000的比例混合，重新轉染大腸桿菌后，按照此方法仍然可以成功地將活性核糖開關挑選出來，證明了遺傳篩選方法的有效性。

Nomura等則利用雙重遺傳篩選方法對核糖開關進行優化[38]，其采用的核糖開關為 TPP依賴型，調控的基因為tet A。有效表達tet A的大腸桿菌對四環素有抗藥性，但對氯化鎳敏感，而不表達tet A的大腸桿菌對四環素敏感，但耐受氯化鎳。通過這種方法，他們從75 000株克隆中成功選擇出優化的功能性TPP核糖開關，激活指數達 11倍。將目的基因更換為綠色熒光蛋白等其他基因時，核糖開關的表達調控作用仍正常發揮，說明該開關可應用于多種基因的表達調控。

傳統遺傳篩選方法雖然可以實現活性核糖開關的選擇，但這些開關的背景表達水平仍較高，核糖開關的激活指數也不夠理想。其原因可能是由于文庫的序列組成仍不夠多樣化，篩選標準是定性而不是定量指標，因此需要更新的篩選方法進行核糖開關的優化。

2.2.2 高通量遺傳篩選

Lynch等將機器人輔助篩選技術應用于核糖開關胞內篩選，極大地提高了工作效率[20]。基于接頭序列對核糖開關功能有顯著影響的認識，他們建立了由65 000種4~8個隨機堿基組成的接頭序列文庫。將含有接頭序列文庫的核糖開關轉化大腸桿菌后，首先在含X-gal但缺乏配體茶堿的選擇性培養基內培養，把不表達報告基因LacZ的白色單菌落挑出，然后分別接種于含或不含茶堿的選擇性培養基內培養，比較同一菌落的激活指數。第一步在無茶堿的條件下選擇白色單菌落是為了降低背景表達水平，防止泄露效應強的核糖開關被選擇。第二步是選擇激活指數高的核糖開關。在第一步篩選過程中，雖然99%的菌落是不需要的藍色菌落，但剩余1%的白色菌落數量就達到4 000株之多，所以必須采用機器人輔助系統才能進行有效選擇。

以細胞運動能力為選擇標準的篩選方法[39]，較上述機器人輔助系統操作簡便，可以很容易地在百萬級文庫內進行篩選。該方法使用的基因為cheZ基因，其表達與否可使大腸桿菌的表現型在原地翻滾和平穩泳動之間轉變。在 cheZ基因不表達的情況下，大腸桿菌在原地翻滾，在半固體瓊脂培養基內不發生遷移。當cheZ基因表達時，大腸桿菌獲得平穩泳動能力，可在培養基內遷移。將大腸桿菌接種于半固體培養基中，選擇在無配體條件下保持在原地，但有加入配體后向周圍遷移的菌落，即可得到含有所需要的核糖開關的菌落。所篩選得到的核糖開關可以指導大腸桿菌沿著配體標記的T型線路遷移，進一步證明了該方法的有效性[40]。該方法僅需要一把標尺即可實現機器人輔助系統所具有的高通量篩選功能，值得推廣。但其缺點是，cheZ基因的過度表達會導致細胞陷于培養基內部而失去活動能力，影響篩選效果。

3 存在問題與解決策略

3.1 配體與核糖開關結構

天然核糖開關一般采用代謝產物作為調節其功能的配體。如果將重組核糖開關應用于基因治療領域，天然代謝產物則不是配體的最佳選擇，因人體內背景濃度的存在會干擾目的基因的緊密調控。生物利用度高、藥理學活性低、體內毒性小的非天然小分子配體應當成為重組核糖開關的首選。雖然基于SELEX技術從理論上可以獲得任何配體的適體，但迄今為止，所獲得的能在生物體內發揮調控作用的適體序列屈指可數，所用的配體幾乎均局限于茶堿、焦磷酸硫胺素 (TPP) 和新霉素等配體，不符合上述首選配體的條件。

在天然核糖開關結構的基礎上進行改造，結合化學篩選和遺傳篩選的手段，正交選擇非天然小分子配體的重組核糖開關，不失為解決上述問題的可選途徑。腺嘌呤是add A核糖開關的天然配體，通過與該核糖開關內4個特定的尿嘧啶結合發揮基因調控作用[41]。將add A核糖開關的尿嘧啶定點突變，采用遺傳篩選技術考察 80種非天然腺嘌呤類似物的調控作用，發現突變體M6與三聚氰酸二酰胺呈現劑量依賴性調控關系，但原配體腺嘌呤則失去了對M6的調控能力。與add A核糖開關相比，M6的基礎基因表達水平有所降低，推測是由于突變引起了轉錄子的錯誤折疊。對位于M6的P2莖結構繼續定點突變，所得到的2種突變體M6’和M6”的基因表達水平明顯提高，但激活指數仍維持在M6的同等水平。

3.2 熱力學與動力學

配體對核糖開關的調控特征常用熱力學指標來評價。配體結合前后核糖開關熱力學穩定性的差異可能是決定其基因調控能力的關鍵因素，因配體結合前后融點差異 (△Tm) 的大小與其基因調控能力成正比[36]。游離的核糖開關處于構象可變的靈活狀態，可保證配體與其功能團發生交互作用。當配體被包裹在核糖開關結合口袋之內后，則形成穩定的有序結構[42-44]。如果熱力學性質是核糖開關性能的決定因素，則可以通過比較配體結合前后熱力學常數，有效預測核糖開關的調控能力，并進一步實施定向改造。

除熱力學因素外，動力學也是影響核糖開關功能的重要因素。對于有足夠的時間與它們所處的環境保持平衡的核糖開關來說，解離常數 (Kd)值是決定其是否因配體濃度做出反應的唯一因素[41]。然而，對于部分轉錄終止型核糖開關，配體結合與RNA聚合酶反應的速度競賽結果，決定了其發揮基因調控能力的高低[45-46]。在形成核糖開關的適體域后，如果配體結合速度不夠快，在終止子或反終止子構象還未形成之時，聚合酶就已經越過該段序列繼續完成 mRNA的合成，調控即宣告失敗。要成功實現調控可能需要胞內的配體濃度足夠高，即滿足動力學調控的條件。這也可能是轉錄終止型重組核糖開關激活指數低于其他類型的原因之一。

3.3 原核生物與真核生物

核糖開關能否在哺乳細胞內同樣發揮基因調控作用，是探索其在基因治療應用前必須要回答的根本問題。迄今為止，幾乎所有的核糖開關均來自細菌等原核生物，TPP核糖開關是唯一在真菌和植物等真核生物內發現的核糖開關，在哺乳細胞內尚未發現天然核糖開關的存在。在生物從低等向高等的進化過程中，蛋白質在基因調控方面似乎占據了上風，低等生物中尚存的核糖開關被認為是基因調控的活化石。核糖開關功能發揮無需蛋白的參與，對于復雜的哺乳細胞來說，可能因核糖開關的作用機制過于簡單而將其淘汰。最近Kim等[28]設計的mRNA選擇性剪接核糖開關在Hela細胞內可以調節mRNA的選擇性剪接，預示了其在哺乳細胞內發揮基因表達轉錄后調節的可能性。Endoh等[47]的研究則表明，轉錄調控型核糖開關與特定蛋白相互配合，也可以在哺乳細胞內發揮基因調控作用，提示我們研究思路的適當調整也許會產生出人意料的結果。

4 展望

構建核糖開關的關鍵是建立高效的配體特異性的適體篩選平臺，獲得適體序列的核心區域；然后可根據表達調控區域的非保守性，結合不同的物種采用相應的基因表達調控機制以實現靶基因的快速、高效和特異的調控，如原核生物多采用轉錄終止型和翻譯啟動型復雜核糖開關；真核生物則多采用 mRNA剪切調控型復雜核糖開關等。組合數學建模設計在優化核糖開關序列，探索核糖開關結構和功能的關系方面也可以發揮重要作用[48]。在明確核糖開關作用機制的基礎上，依據生物信息學和構效分析，可進一步設計通用型的核糖開關，用于不同組織和細胞內靶基因表達調控；同時也可以設計組織特異性核糖開關，用于腫瘤等疾病的靶向治療。

核糖開關的發現再一次改變了人們對 RNA的固有觀念，近 10年的研究初步揭示了其作用機制的新穎性、多樣性及復雜性。通過適體域和表達平臺的拼接構建可以在細胞內發揮基因表達調控作用的重組核糖開關的研究思路，現在看來雖然可行，但距離成功應用尚為時過早。天然核糖開關經歷了數十億年的進化演變才得以實現，在對其機理的認識仍嫌淺薄的今天，試圖在實驗室內用幾周時間就制備出性能卓越的核糖開關太過樂觀。但是隨著對其構效關系及作用機理的深入了解，高通量自動化體內篩選技術的建立和日益成熟，借助計算機輔助設計等新型手段，及時調整研究思路與方法，核糖開關這一“化石”級調控元件一定可以在基因治療的嶄新領域發揮重要作用。

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