再生胰腺提取物誘導人羊膜間充質干細胞定向分化為胰島素分泌細胞

張艷梅，王佃亮，曾虹燕，王烈明，孫晉偉，張珍，東莎莎

1 中國人民解放軍第二炮兵總醫院中心實驗室，北京 100088

2 湘潭大學生物技術研究所，湖南 湘潭 411105

胰島移植是一種有效治療糖尿病的方法，但目前用于移植的胰島主要是來源于尸體捐贈者，來源緊缺和免疫排斥反應嚴重阻礙了胰島移植的推廣應用，因此尋找可替代β細胞移植的細胞資源成為移植研究的必然趨勢。干細胞因其具有自我復制和多向分化潛能成為替代細胞的最佳選擇。胚胎干細胞雖然可以誘導分化為胰島素分泌細胞，但因其倫理爭議和形成畸胎瘤的危險而受到阻礙[1]。已有研究證明骨髓[2]、肝[3]、胰膽管[4]、臍帶血[5]和皮膚[6]等來源的成體干細胞在體外可以成功誘導分化為胰島樣細胞。相對于以上諸多干細胞，hAMSCs具有取材方便，免疫原性低，增殖能力強和向3個胚層來源的組織細胞分化的潛能等優勢[7-8]，在細胞替代治療領域顯現出更為可觀的前景。大鼠胰腺部分切除后具有胰腺再生功能，并且胰腺部分切除后的再生胰腺提取物具有激發糖尿病大鼠胰島再生和血糖恢復的功能[9]，而這種激發再生機制是否和干細胞的誘導機制有關？本課題組利用大鼠胰腺再生提取物對hAMSCs進行了誘導研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

達氏修正依氏培養基 (DMEM) (Sigma)；F12 (Sigma)，胎牛血清 (Fetal Bovine Serum，FBS) (Gibico)，胰蛋白酶 (Gibico)，膠原酶Ⅱ和DNaseⅠ (Roche)，重組人堿性成纖維細胞生長因子 (Recombinant human basic fibroblast growth factor，rhbFGF) (Sino)，雙硫腙 (Dithizone，DTZ) (Sigma)，小鼠抗人胰島素抗體 (Boster)，FITC標記的羊抗小鼠IgG (Boster)，凱基Super一步法RT-PCR試劑盒 (凱基生物)，人胰島素 (INS)試劑盒 (Invitrogen)，SD大鼠 (軍事醫學科學院動物中心)。

1.2 hAMSCs的分離培養

細胞分離參考 Huo等的方法[10]，并在此基礎上改進：經產婦知情同意后于無菌條件下，取足月剖宮產胎盤 (HIV、梅毒等檢測結果為陰性)，鈍性分離臍帶近端羊膜組織，剪成6 cm× 6 cm大小的羊膜片，用含雙抗的PBS緩沖液多次洗滌。本實驗先將羊膜組織置于無菌培養皿中，細胞刮刀刮除未洗滌的血塊和初步刮除羊膜上皮細胞，PBS沖洗，而后才將羊膜盡量剪碎，采用體積比為 1∶1的 0.25%胰酶和 0.02% EDTA 37 ℃消化60 min，過100目細胞篩網，收集羊膜碎皮，1 g/L膠原酶Ⅱ和0.1 g/L DNaseⅠ(體積比1∶1) 37 ℃消化60 min，過300目細胞篩網，收集過濾細胞液，1 000 r/min離心5 min，苔盼藍染色計數，5×106個/mL接種細胞于25 cm2透氣培養瓶，含10% FBS的DMEM/F12培養基、37 ℃、0.5% CO2培養箱培養，3 d首次換液，細胞90%鋪滿板底時，1∶2傳代培養。實驗的分離方法通過細胞刮刀輔助去除血塊和羊膜上皮，利用EDTA輔助消化，節省了實驗時間，提高了細胞的提取率和成活率，而且最后采用的細胞篩網是300目的可以充分去除未消化完全的細胞團或羊膜碎片組織，提高細胞的純度，更方便細胞培養。

1.3 大鼠胰腺提取物的制備

生物誘導劑的提取是在Lee等[11]方法的基礎上略有修改：將6~8周齡的SD大鼠腹腔麻醉，從胰尾端開始行60%胰腺切除手術，而后縫合傷口，正常喂養3 d后，斷頸處死大鼠，提取剩余的胰腺組織，在加有1 μg/mL蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中研磨勻漿，以3 000 r/min和12 000 r/min，4 ℃分別離心10 min和20 min，收集上清液，0.22 μm針式過濾器過濾除菌，分裝后，?80 ℃低溫冰箱保存待用。

1.4 hAMSC的誘導分化

用12孔板培養第3代hAMSCs，當細胞鋪滿板底 60%左右時，向其中加入最終濃度為20 mg/L的RPE，3 d換液，定期觀察誘導狀況。

1.5 雙硫腙染色

細胞培養15 d后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，而后，加入0.1 g/L的雙硫腙染色液，37 ℃孵育30 min，倒置顯微鏡下觀測染色結果。雙硫腙染色液的配置參照侯萍等的方法[12]。

1.6 免疫熒光檢測

PBS緩沖液洗滌誘導結束的細胞3次，用4%的多聚甲醛室溫固定細胞20 min，PBS洗滌5 min/次×2次；1%牛血清蛋白封閉液室溫封閉30 min，去除非特異性陽性；滴加一抗鼠抗人胰島素抗體，4 ℃孵育過夜；移除一抗，PBS洗滌3次，5 min/次；滴加FITC熒光標記的二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，5 min/次；熒光顯微鏡下觀測拍照。

1.7 RT-PCR檢測

取誘導 15 d后的細胞，用 Trizol提取總RNA。然后通過RT-PCR方法檢測以下基因的表達：insulin和Pdx1。該實驗采用的是凱基Super一步法RT-PCR試劑盒，RT反應條件：42 ℃保溫1 h。PCR擴增條件：94 ℃，5 min；94 ℃變性30 s，最適退火溫度退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析并紫外成像系統拍照。引物序列及退火溫度見表1。

1.8 誘導細胞的胰島素分泌檢測

將誘導成功的細胞和對照組細胞 (未經誘導的hAMSCs) PBS緩沖液洗滌3次，而后于加有 30 mmol/L的葡萄糖的 10% FBS的DMEM/F12培養基培養，于0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h各時間點取0.2 mL培養液上清，3 000 r/min低溫離心10 min后取上清，于?80 ℃低溫冰箱保存待一起測定胰島素含量。胰島素檢測按照胰島素檢測試劑盒說明書嚴格操作。

2 結果

2.1 hAMSC的生長狀況與特性

本實驗分離hAMSCs時，結合使用細胞刮刀刮除上皮，降低酶作用時間和提高細胞存活率，分離獲得的細胞量高達108個/mL。hAMSCs隔夜貼壁，5~7 d首次傳代，P1代細胞培養中可見兩種形態細胞的生長，一種梭形的hAMSCs，生長增殖迅速，一種鵝卵石狀 (圖1A單箭頭所示)或煎雞蛋狀 (圖 1A雙箭頭所示) 的羊膜上皮樣細胞，貼壁牢固，增殖緩慢，不易消化。傳至P3代，細胞形態均一，呈漩渦狀生長，基本為純的hAMSCs (圖1B)。

2.2 誘導分化結果

RPE誘導的hAMSCs形態變化明顯，誘導8 d后就可見細胞呈簇集落生長，誘導15 d后，細胞幾乎分化融合為一團，呈小島狀生長 (圖2)。

圖1 hAMSC的形態Fig. 1 Morphology of hAMSCs. (A) Primary cells cultured for 7 d. Double-headed arrow showed the amniotic epithelial-like cells. Single-headed arrow indicated the egg-shaped elliptical cells. Round arrow showed the spindle cell. (B) The third passage hAMSC, uniform cell morphology, like some whirlpools.

圖2 hAMSC的誘導分化Fig. 2 Differentiation of hAMSCs. (A) Cells before RPE-treating. (B) Cells after RPE-treating for 8 days. (C) Cells after RPE-treating for 15 days, like some small islands.

2.3 雙硫腙染色結果

胰島β細胞含有高濃度鋅，雙硫腙是很強的螯合劑，能與β細胞中的鋅結合呈現猩紅色，故可以作為胰島的染色劑。實驗通過雙硫腙來染色誘導后的細胞，在顯微鏡下觀測可見猩紅色團狀細胞簇。對照組則無顏色顯示 (圖3)。

2.4 免疫熒光檢測結果

通過細胞的免疫熒光法檢測誘導干細胞是否如胰島細胞具有胰島素分泌功能，由圖4A可見，誘導細胞呈胰島素陽性表達，而非 RPE誘導組的胰島素無表達 (圖4B)。

2.5 RT-PCR檢測結果

實驗通過RT-PCR檢測誘導細胞是否有胰島細胞的相關基因表達，圖5實驗結果顯示，誘導細胞不僅可以表達人胰島素、胰高血糖素等基因的激活因子Pdx1，同時也表達人insulin，而在對照組未經誘導的hAMSCs中未見insulin和Pdx1的表達，這就從基因學角度證明了誘導后的細胞具有胰島細胞的部分生物學特性。

2.6 誘導細胞胰島素分泌情況

圖6是經高糖刺激后，誘導細胞在不同時間點的胰島素分泌情況，可見誘導細胞不僅可以分泌胰島素，而且隨著高糖刺激的時間的延長，分泌量增多，但增加到一定的程度，就會逐漸趨于穩定，而對照組非誘導 hAMSCs則無胰島素分泌，對照組的非零數據值屬于實驗誤差范圍。

圖3 雙硫腙染色Fig. 3 Dithizone staining. (A) The induced hAMSCs were positive for dithizone staining. Cell clusters were stained scarlet. (B) Control cells without RPE induction.

圖4 胰島素免疫熒光結果Fig. 4 Insulin immumofluorescence. (A) Induced hAMSCs. (B) hAMSC control. Immunofluorescence analysis revealed islet-like clusters differentiated from hAMSC were insulin-positive cells.

圖5 誘導細胞的RT-PCR分析Fig. 5 RT-PCR analysis of induced cells. 1: Pdx 1; 2: control 1 (Pdx1 expression of hAMSCs without inducing); 3: insulin; 4: control 2 (insulin gene expression of hAMSCs without inducing); 5: β-action. Pdx1 and insulin were positive expression in induced cells, but negative in control hAMSC.

圖6 高糖刺激后誘導細胞的胰島素分泌情況Fig. 6 Insulin secretion of induced hAMSCs after high glucose stimulation. Induced hAMSCs had increased insulin secretion with the glucose-stimulating time. The control hAMSCs didn’t secret insulin.

3 討論

近年來國內外對干細胞誘導分化為胰島樣細胞的研究較多，采用的干細胞主要有胚胎干細胞[13-14]和成體干細胞 (臍血來源干細胞、骨髓來源干細胞、胰腺干細胞、脂肪干細胞、肝來源干細胞和神經干細胞)[15-18]，誘導方法總體上有一步誘導法、二步誘導法和三步誘導法，有的用到了五步法，使用的誘導劑也很多，包括角質化細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、activin-A，GLP-1、煙酰胺和 ITS介質 (I-胰島素、T-轉鐵蛋白、s-硒) 等[19]，雖然實驗誘導出胰島樣細胞，但成本高、耗時長，誘導率低。

本實驗采用的是胎盤來源的人羊膜間充質干細胞，具有來源廣泛、增殖能力強、免疫原性低和造血支持等優勢[8]，但目前尚未報道其體外向胰島樣細胞誘導的研究。采用的誘導劑是異種來源的再生胰腺提取物，屬于天然生物誘導劑，成分更接近于機體微環境中成分，而且制取方便，成本低且誘導步驟簡便，誘導率較高。Lee等[11]和Choi等[20]都利用RPE分別將脂肪干細胞和骨髓間充質干細胞成功誘導為具有胰島表型的細胞。本實驗采取的是第3代hAMSCs細胞，誘導15 d后就明顯可見類胰島樣細胞團，經雙硫腙染色后初步斷定其具有胰島細胞的特性。Pdx1和 insulin的陽性表達從基因學的角度證明了誘導的成功，而胰島素分泌檢測是從細胞功能的角度證明了hAMSCs的成功誘導?？梢娫偕认偬崛∥锊粌H具有促進胰腺再生的功能，而且具有調控和促進不同種屬的干細胞向胰島分泌細胞分化的功能。

本研究表明異種來源的胰腺再生提取物可以誘導hAMSCs分化為胰島素分泌細胞，為糖尿病細胞替代治療提供了新的細胞來源和新的干細胞誘導技術方案。至于誘導成功的胰島素分泌細胞是否在體內發揮正常作用，及是否具有其他致畸等副作用，還有待進一步研究。

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