衣康酸產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與展望

何敏超，張 宇，許敬亮*，袁振宏

（中國科學(xué)院 廣州能源研究所，中國科學(xué)院可再生能源與天然氣水合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

衣康酸學(xué)名為甲叉琥珀酸、亞甲基丁二酸[1-2]，是世界上第五大有機(jī)酸（前四位依次為：檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸和蘋果酸），是一種不飽和二元有機(jī)酸。其含不飽和雙鍵，具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，可進(jìn)行自身間的聚合，也能與其他單體如丙烯睛等聚合，溶于水、乙醇等溶劑；能進(jìn)行各種加成反應(yīng)，酯化反應(yīng)和聚合反應(yīng)，是化學(xué)合成和化工生產(chǎn)的重要工業(yè)原料，被譽(yù)為有機(jī)酸領(lǐng)域中皇冠上的寶石。衣康酸的分子結(jié)構(gòu)式：

其主要用途[3-4]如下：

a）衣康酸及其聚合物添加少量天然物質(zhì)可制成高效除臭劑和具有除臭功能的塑料與紙張等特殊產(chǎn)品。

b）衣康酸與苯乙烯及丁二烯共聚可制成SBR乳膠（Styrene Butadiene Rubber，苯乙烯一丁二烯橡膠），可用于紙張涂膜、金屬與混凝土涂料、油漆添加劑和地毯上漿等。

c）衣康酸與丙烯酸或甲基丙烯酸或其酯類聚合制成樹脂，具有阻垢作用，可用于表面涂層及乳化漆。

d）衣康酸制成酯類可用于油漆、弱酸性離子交換樹脂、潤滑油添加劑、粘結(jié)劑和增塑劑、粉壓塑料以及密封膠。

e）衣康酸用于其他衍生物可用作醫(yī)藥、化妝品試劑、潤滑劑、增稠劑、除草劑以及改善絲毛紡織性能。

f）衣康酸是生產(chǎn)檸康酸、中康酸、衣康酸酐等的原料。

隨著衣康酸所具有的獨(dú)特性能日益被人們所認(rèn)識，其應(yīng)用范圍正迅速擴(kuò)大，因而衣康酸的潛在市場是不容忽視的，具有廣闊的發(fā)展前景。同時隨著衣康酸的生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)步和生產(chǎn)成本不斷降低，衣康酸的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)絹碓綇V泛。

1 衣康酸生產(chǎn)現(xiàn)狀

目前，全世界每年的衣康酸產(chǎn)能達(dá)到8萬t～10萬t，我國是世界上衣康酸的最大生產(chǎn)國和出口國。我國從事衣康酸生產(chǎn)的企業(yè)有：青島科海生物有限公司（2萬t～5萬t）、浙江國光生化股份有限公司（1.5萬t）、濟(jì)南華明生化公司（1.5萬t）和成都拉克生物工程實(shí)業(yè)有限公司（0.2萬t）。除此之外，尚有諸多待建的衣康酸生產(chǎn)項(xiàng)目，如：德州華茂生物科技有限公司擬投資1.3億建設(shè)年產(chǎn)3萬t的衣康酸。

2 衣康酸產(chǎn)酸菌株選育研究進(jìn)展

衣康酸優(yōu)良菌株的選育，既需要選擇合適的微生物種類作為出發(fā)菌株，更需要產(chǎn)酸代謝途徑的理論指導(dǎo)。惟其如此，才能夠不斷地選育出發(fā)酵性能優(yōu)異的工業(yè)化菌株。

2.1 衣康酸發(fā)酵微生物種類

能生產(chǎn)衣康酸的微生物種類有很多[1，5]，如土曲霉（Asp.terrus）、衣康酸曲霉（Asp.itaconicus）、假絲酵母（Candida species）、紅酵母（Rhodotrorula）、黑粉菌（Ustilago）、查爾斯青霉（Penicillum charlesii）和黑曲霉（Asp.niger）。但是，只有土曲霉的產(chǎn)酸能力可以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。土曲霉屬于半知菌綱、叢梗孢目、叢梗孢科。

2.2 衣康酸產(chǎn)酸代謝途徑

表1 國內(nèi)主要衣康酸廠家情況Table 1 Major itaconic acid manufacturers in China

表2 國外主要衣康酸廠家情況Table 2 Major itaconic acid manufacturers outside of China

衣康酸的生物合成機(jī)理主要有以下3種[5]：

葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)合成檸檬酸之后，再脫水脫羧生成衣康酸，途徑如下：

也有人認(rèn)為可能直接由乙酰CoA和丙酮酸合成檸蘋酸，再由檸蘋酸失水生成衣康酸，途徑簡示如下：

無論是上邊哪一條途徑，總的反應(yīng)式為：

上述反應(yīng)式對糖的轉(zhuǎn)化率為72%。由此可見，HAT418最高的糖酸轉(zhuǎn)化率67.83%和NLYT-2-801的最高轉(zhuǎn)化率69.1%似乎還有一定的提升空間。

乙酸和琥珀酸先縮合成三羧酸，再脫氫脫羧生成衣康酸，此種反應(yīng)對于糖的理論轉(zhuǎn)化率為48%，詳細(xì)途徑如下：

2.3 衣康酸產(chǎn)酸菌株選育研究進(jìn)展

生物發(fā)酵領(lǐng)域中，優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是支撐起一個企業(yè)、乃至一個行業(yè)健康發(fā)展的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。目前，國內(nèi)外在衣康酸產(chǎn)酸菌株選育方面已開展了大量卓有成效的研究工作，許多產(chǎn)酸菌株已經(jīng)獲得工業(yè)化應(yīng)用，而且取得了不錯的效果。

2.3.1 我國衣康酸產(chǎn)酸菌株選育

衣康酸產(chǎn)酸菌株的性能優(yōu)劣，不僅取決于其產(chǎn)量高低，而且要求其在發(fā)酵周期、發(fā)酵最適溫度、轉(zhuǎn)化率和碳源利用能力方面都具有優(yōu)異的性能。我國作為衣康酸的生產(chǎn)大國，與我國科研人員在衣康酸產(chǎn)酸菌株選育方面付出的艱辛勞動密切相關(guān)。經(jīng)過我國幾代科研人的研究開拓，目前已獲得幾株具有工業(yè)應(yīng)用價值的產(chǎn)酸菌株。但迄今為止，我國衣康酸菌株都是利用傳統(tǒng)的誘變選育技術(shù)獲得的。

表3 我國衣康酸產(chǎn)酸菌株選育概況Table 3 Strain breeding for itaconic acid production in China

徐建春等[9]以土曲霉NLYT234為出發(fā)菌株，利用紫外、高溫、氯化鋰等誘變方法，成功選育到1株產(chǎn)酸水平達(dá)92.1g/L的菌株NLYT-2-801。劉建軍等[10]以土曲霉No.201為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外，亞硝基胍、高溫、硫酸二乙酯等誘變，獲得了菌株HAT418，其產(chǎn)酸水平高達(dá)81.4g/L～101.1g/L。其后，其在2006年進(jìn)一步改造了HAT418，使其發(fā)酵周期減至40h，轉(zhuǎn)化率維持在65%，玉米漿用量減少30%，硫酸根離子濃度減少5倍[11]。

菌株的轉(zhuǎn)化率由菌株本身決定外，還受到外界因素的影響，如發(fā)酵溫度。從表3可以看到，HAT418和NLYT-2-801的轉(zhuǎn)化率都已經(jīng)達(dá)到了63.18%～67.83%，產(chǎn)量也都超過了80g/L。而T730的轉(zhuǎn)化率雖然達(dá)66%，但產(chǎn)酸水平卻不足6.6%。因此，不能單純的追求過高的轉(zhuǎn)化率或者產(chǎn)量，而應(yīng)該從產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵周期等多個方面進(jìn)行綜合考慮。優(yōu)良的產(chǎn)酸菌株應(yīng)該體現(xiàn)在更短的發(fā)酵周期里達(dá)到最高的產(chǎn)量。

發(fā)酵周期從根本上決定了生產(chǎn)設(shè)備的利用率。因此，發(fā)酵周期長短是決定一個發(fā)酵菌株是否優(yōu)良的關(guān)鍵。經(jīng)過我國科研人員堅(jiān)持不懈的努力，目前衣康酸產(chǎn)酸菌株的發(fā)酵周期已從原來的96h～144h減少至現(xiàn)在的40h[11]。另外，耐受高溫也是優(yōu)良菌株一個非常重要的特性。耐高溫菌株在較高溫度（38℃～42℃）條件下進(jìn)行發(fā)酵，可以較大幅度地節(jié)省炎熱夏季的冷卻費(fèi)用。如NLYT-2-801的發(fā)酵溫度為40℃～43℃，HAT418的發(fā)酵溫度也達(dá)34℃～38℃。

T730和15-UV-07都是以NRRL1960為出發(fā)菌，經(jīng)過一系列不同的誘變方法，其產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率也截然不同。T730的產(chǎn)酸量為6.6%、轉(zhuǎn)化率為66%，而15-UV-07的產(chǎn)酸量為84g/L，轉(zhuǎn)化率為52.5%。

2.3.2 國外衣康酸產(chǎn)酸菌株選育

目前國外已經(jīng)報到的衣康酸菌株產(chǎn)酸水平普遍較低。較低發(fā)酵水平在28g/L～35.9g/L[12-13]，較高水平則為82g/L[14]。國外的菌株不僅在產(chǎn)量上與我國的菌株存在較大的差距，而且在發(fā)酵周期也存在著很大的差距。國外的產(chǎn)酸菌株發(fā)酵時間一般為144h～168h，而我國目前的工業(yè)化菌株發(fā)酵周期可不超過40h。

目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)中利用產(chǎn)酸基因進(jìn)行外源表達(dá)或者同源表達(dá)的研究較少，大多集中在代謝關(guān)鍵酶的機(jī)理研究。如6-磷酸果糖-1-激酶是糖酵解過程中關(guān)鍵的異構(gòu)調(diào)節(jié)酶，能夠磷酸化果糖-6磷酸生成果糖-1，6-磷酸。TEV? G等[15]將3種不同的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化土曲霉原生質(zhì)體，這3種表達(dá)載體分別是pRCR-PFK1、pRCR-pfk10和pRCRmt-pfkA10。在父本菌株衣康酸產(chǎn)量為13.5g/L的情況下，含有pRCR-PFK1基因的轉(zhuǎn)化子、含有pRCR-pfk10表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子和含有pRCR-mt-pfkA10表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)量分別是13g/L、23g/L和31g/L。研究結(jié)果表明，通過將修飾過的黑曲霉pfkA基因嵌入土曲霉，衣康酸產(chǎn)量得到了較大的提升。

順烏頭酸脫羧酶催化順烏頭酸轉(zhuǎn)化為衣康酸，是衣康酸合成途徑中最后一步的酶。KANAMASA S[16]分別從A.terreusIFO6365和A.terreusTN484-M1中提取編碼順烏頭酸脫羧酶編碼基因，去掉順烏頭酸脫羧酶基因的內(nèi)含子后，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pAUR-CAD1，并最終將該表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入S.cerevisiae中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，導(dǎo)入pAUR-CAD1質(zhì)粒的菌株，順烏頭酸脫羧酶的活性為（276.1±30.1）mU/mg，而不含順烏頭酸脫羧酶質(zhì)粒的菌株，順烏頭酸脫羧酶的活性僅為（37.9±8.4）mU/mg。除此之外，其另一個實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，順烏頭酸基因表達(dá)水平更高的菌株，其衣康酸產(chǎn)量更高。這個結(jié)論在衣康酸菌株選育方面具有積極的指導(dǎo)意義。

除此之外，也有研究者[17]將土曲霉的產(chǎn)酸基因?qū)牒谇惯M(jìn)行表達(dá)，但最終的產(chǎn)酸量不到1g/L。

3 衣康酸發(fā)酵工藝研究概況

對于發(fā)酵性能優(yōu)異的菌株，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化挖掘其發(fā)酵潛能具有積極的意義。菌株的優(yōu)良的發(fā)酵性能可以較大幅度地降低發(fā)酵成本，并最終提升產(chǎn)品的競爭優(yōu)勢。我國衣康酸菌株的產(chǎn)酸水平、發(fā)酵溫度和發(fā)酵周期無疑具有很強(qiáng)的競爭優(yōu)勢。

國外的發(fā)酵產(chǎn)酸水平最高為82g/L[4]，而我國衣康酸產(chǎn)酸菌株[18-25]水平大多為39.2g/L～101.1g/L，轉(zhuǎn)化率為54.9%～69.71%，發(fā)酵周期為72h～168h，一些工業(yè)化發(fā)酵菌株的發(fā)酵周期可短至40h～47h。我國目前在應(yīng)用的產(chǎn)酸菌株，其發(fā)酵最適pH值通常在2.0～3.0，也有采用自然pH值或pH值為4～5，發(fā)酵溫度多為34℃～37℃。但耐高溫菌株選育是今后的一個重點(diǎn)發(fā)展方向，能有效節(jié)約發(fā)酵生產(chǎn)成本。

目前，我國衣康酸的年產(chǎn)能在8萬t～10萬t，而且，隨著衣康酸應(yīng)用范圍不斷地擴(kuò)大和深入，其需求量也將不斷增加。因此，按照65%的轉(zhuǎn)化率計算，我國衣康酸行業(yè)每年至少需要消耗12.3萬t～15.38萬t玉米。我國雖然是世界上最大的衣康酸生產(chǎn)國和出口國，但同時也是世界上最大的糧食進(jìn)口國之一。早在2005年，我國就已經(jīng)成為糧食凈進(jìn)口國。因此，積極探索衣康酸發(fā)酵生產(chǎn)的原料多元化途徑就顯得尤為必要。

目前，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)著手開展利用其他碳源代替玉米淀粉生產(chǎn)衣康酸的研究。無錫輕工業(yè)學(xué)院[26]與廣東雷州市越利衣康酸有限公司合作，建立年產(chǎn)1000t衣康酸工廠。該項(xiàng)目使用當(dāng)?shù)氐哪臼矸塾?995年1月一次性試產(chǎn)成功，產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到日本和美國的衣康酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。也有研究者[27]利用馬鈴薯淀粉、也有人采用玉米芯和麩皮[23]甚至NUBEL RC[18]等利用糖蜜、木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸研究進(jìn)行發(fā)酵研究。但這些研究的發(fā)酵水平和發(fā)酵成本都遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

劉建軍等[1]認(rèn)為，使用比較粗、成本低廉的原料生產(chǎn)衣康酸，雖然原料成本較低，但最終的生產(chǎn)成本并不低。采用精料可有效減少廢渣的排放，更有利于產(chǎn)品的提取和回收。但考慮到我國糧食資源的短缺性以及木質(zhì)纖維素原料來源的廣泛性，未來利用農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸探索和嘗試無疑具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義。

為了選育到能夠利用農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸的高產(chǎn)菌株，初步摸索了實(shí)驗(yàn)室保藏的5株衣康酸菌株的發(fā)酵性能。在利用100g/L蔗糖進(jìn)行發(fā)酵時，菌B衣康酸的產(chǎn)量達(dá)到62.34g/L，菌E衣康酸的產(chǎn)量也達(dá)61.9g/L。不同的菌，其最佳的氮源并不一致。菌A、菌C、菌D和菌E最佳的氮源是硫酸銨，而菌B不能夠利用無機(jī)氮源。另外，還發(fā)現(xiàn)了在pH值為2時，4個菌都不能產(chǎn)酸，菌E雖然能夠產(chǎn)酸，但是產(chǎn)酸量較低。

4 總結(jié)及展望

1990年之前，我國的衣康酸還需要從美國和日本進(jìn)口。如今，我國已經(jīng)成為世界上最大的衣康酸生產(chǎn)國和出口國。而這一切離不開我國衣康酸科研人員在菌種選育方面所取得的突出成就，如康酸產(chǎn)量達(dá)81.4g/L～101.1g/L，發(fā)酵周期驟減至不到40h，轉(zhuǎn)化率高達(dá)67.83%～69.71%，而且菌株耐高溫的特性決定了在炎熱的夏季進(jìn)行發(fā)酵可以顯著縮減降溫費(fèi)用。衣康酸工業(yè)菌株上述的這些特性，是我國衣康酸具有極強(qiáng)競爭力的關(guān)鍵。不過，由于我國人口眾多，加之耕地面積持續(xù)銳減，因此，積極探索可替代來源于玉米淀粉的發(fā)酵碳源（如木質(zhì)纖維素水解液、蔗糖糖蜜、甜菜糖蜜等）就顯得尤為迫切。國內(nèi)外已經(jīng)開展了利用農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸的研究，并取得一些研究成果。隨著可利用農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)酸菌株選育研究的開拓和提升，我國將會在生物質(zhì)精煉衣康酸方面獲得一些重大的突破。

[1]劉建軍，姜魯燕，李丕武，等.衣康酸的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用[J].山東科學(xué)，2002，15（3）：38-42.

[2]楊 華.國內(nèi)外衣康酸生產(chǎn)消費(fèi)與市場分析[J].上海化工，2007（32）：46-48.

[3]WILLKE TH，VORLOP K D.Biotechnological production of itaconic acid[J].Appl Microbiol Biot，2001（56）：289-295.

[4]OKABE M,LIESD,KANAMASA S,et al.Biotechnological production of itaconic acid and its biosynthesis inAspergillus terresu[J].Appl Microbiol Biot,2009(84):597-606.

[5]王博彥，金其榮.發(fā)酵有機(jī)酸生產(chǎn)與應(yīng)用手冊[M].第1版.北京：中國輕工業(yè)出版社，2000.

[6]葉金寶，徐建妙，鄭裕國.離子注入選育高產(chǎn)衣康酸菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].發(fā)酵科技通訊，2009，38（4）：6-10.

[7]劉建軍，姜魯燕，李丕武.發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸技術(shù)的研究——衣康酸生產(chǎn)菌株的選育（Ⅰ）[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，29（2）：17-21.

[8]李家琪，謝 彪.衣康酸菌種的選育[J].四川制糖發(fā)酵，1990，17（4）：7-13.

[9]徐建春，李 霞，王海英.發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸—高產(chǎn)菌株的選育[J].發(fā)酵科技通訊，2008，37（1）：30-32.

[10]劉建軍，姜魯燕，李丕武，等.發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸技術(shù)的研究—衣康酸發(fā)酵工藝條件的研究（Ⅱ）[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（4）：27-32.

[11]劉建軍，趙祥穎，田延軍，等.精制衣康酸生產(chǎn)工藝的研究與推廣[J].山東食品發(fā)酵，2006（4）：1-1.

[12]FUTAMURA T，OKABEM，TAMURA T,et al.Improvement of production of kojic acid by amutant strainAspergillus oryzae,MK107-39[J].J Biosci Bioeng,2001,91（3）:272-276.

[13]KIRIMURA K，SATOT，NAKANISHIN,et al.Breeding of starch-utilizing and itaconic-acid-producing kojimoldsby interspecific protoplast fusion betweenAspergillus terreusandAspergillus usamii[J].Appl Microbiol Biot，1997，(47):127-131.

[14]YAHIRO K,TAKAHAMA T,SOPARK Y,et al.Breeding ofAspergillus terreusMutant TN-484 for itaconic acid production with high yield[J].J Ferment Bioeng，1995,79（5）:506-508.

[16]KANAMASA S,DWIARTIL,OKABEM,et al.Cloning and functional characterization of the aconiticacid decarboxylase(CAD)gene fromAspergillus terreus[J].Appl Microbiol Biot，2008(80):223-229.

[17]LIA,LUIJK N,BEEK M,et al.A clone-based transcriptomics approach for the identification of genes relevant for itaconic acid production inAspergillus[J].Fungal Genet Biol，2011，(48)：602-611.

[18]NUBEL RC,RATAJAK ED.Process for producing itaconic acid[P].US:3,044,941(to Pfizer),1964.

[19]賈士儒，王明霞，陳貴斌，等.衣康酸發(fā)酵工藝的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25（2）：39-42.

[20]朱 萍.融合子F3產(chǎn)衣康酸的培養(yǎng)基組成及搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33，（9）：46-49.

[21]楊玉華，何伯安，李慧林，等.衣康酸小試發(fā)酵條件研究[J].河南科學(xué)，1994，12（1）：75-78.

[22]吳 敬，吳梧桐.衣康酸高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)[J].藥物生物技術(shù)，1997，4（3）：154-157.

[23]俞志敏，吳 克，金 杰，等.農(nóng)用廢棄物固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸工藝研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（1）：99-102.

[24]柴紅梅，趙永昌，宋令榮，等.衣康酸高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵工藝研究[J].生物技術(shù)，1999，9（6）：27-32.

[25]賴 霞，印培民，黃筱萍.發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸的工藝條件研究[J].中國釀造，2008（22）：80-83.

[26]徐 勤.木薯粉生產(chǎn)衣康酸成功[J].江蘇食品與發(fā)酵，1995（1）：41.

[27]賀小賢，孫福林，劉苗苗，等.馬鈴薯淀粉產(chǎn)衣康酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國釀造，2012，31（1）：80-84.